Trong công nghệ sản xuất trehalose biến đổi sinh học bằng phương pháp enzyme được coi là phương pháp tiếp cận mới được ưu tiên sử dụng hơn so với phương pháp chiết xuất từ sinh khối vi sinh vật hay thực vật. Một trong những enzyme dùng để sản xuất trehalose quy mô lớn là hệ enzyme gồm maltooligosyl trehalose synthase (MTSase, EC 5.4.99.15) và maltooligosyl trehalose trehalo- hydrolase (MTHase, EC 3.2.1.141). MTSase xúc tác cho phản ứng thủy phân maltooligosaccharit (mức độ trùng hợp phân tử glucoza >3) thành maltooligo- syl trehalose bằng chuyển đổi glycosyl hóa nội phân tử, sau đó MTHase thủy phân đặc hiệu maltooligosyl trehalose thànhtrehalose [9].
Enzyme MTSase và MTHase xúc tác lặp lại trên liên kết-1,4-glucosit và bị dừng lại ở các vị trí mạch nhánh tinh bột (liên kết a-1,6), do đó để phản ứng xảy ra hoàn toàn với tinh bột, cần thiết phải bổ sung enzyme thủy phân cấu trúc phân nhánh của tinh bột vào giai đoạn đường hóa như isoamylase hay pullu- lanase [5]. Mặt khác, trong giai đoạn cuối của phản ứng, một số oligosacarit có trọng lượng phân tử thấp như gluco- za, maltose, maltotriose và các dextrin mạch ngắn luôn được tích lũy, bổ sung cyclomaltodextrin glucanotransfer-ase (CGTase) nhằm trùng hợp các oli- gosacarit có trọng lượng phân tử thấp thành oligosacarit có trọng lượng phân tử cao bởi phản ứng thuận nghịch CG- Tase, sản phẩm là cơ chất cho MTSase và MTHase hoạt động [10]. Do đó, để tăng hiệu suất quá trình chuyển hóa, cần bổ sung enzyme phân cắt mạch nhánh của tinh bột và enzyme tổng hợp các oligosacharit có trọng lượng phân tử thấp thành hợp chất có trong lượng phân tử cao, từ đó enzyme MTSase và MTHase có thể dễ dàng để chuyển hóa, tổng hợp trehalose[10].
2.1.2. Tinh bột: Tinh bột sắn mua trên thị trường, bột có mầu trắng, nhỏ mịn, mùi thơm, không có mùi, vị lạ, hàm lượng tinh bột đạt > 80%, độ ẩm 12-14%.
2.2. Phương pháp công nghệ
2.2.1. Phương pháp thủy phân tinh bột sắn thành đường maltooligosac- charit
Xử lý nguyên liệu: Phối trộn tinh bột sắn hòa với nước theo tỷ lệ 1:4, khuấy đảo liên tục, khuấy mạnh để nước hòa tan dịch tinh bột rồi để yên. Đến khi tinh bột đã lắng gần hết xuống đáy thành một lớp thì ta gạn bỏ phần nước phía trên, thêm nước mới sạch, khuấy mạnh và để yên, quá trình xử lý lập lại 4 lần [1].
Quá trình dịch hoá: Nồng độ tinh bột: 25%, nồng độ enzyme SEBrew HT 6 KNS/g tinh bột (tương đương 0,05%), pH = 6,5, nhiệt độ: 800C, thời gian: 30 phút. Kết thúc phản ứng bằng cách nâng nhiệt lên 1000C trong 15 phút [1].
Quá trình đường hoá: Nồng độ dịch thuỷ phân: 220Bx, sử dụng Isoamylase ở nồng độ thích hợp và thời gian phản ứng 16 giờ, nhiệt độ: 55°c, pH = 6,0 [3, 6].
2.2.2. Phương pháp chuyển hóa, tổng hợp đường trehalose
Dịch tinh bột sắn sau quá trình dịch hóa, được ốn định ở pH, nhiệt độ thích họp, tiến hành qáu trình đường hóa và bố sung MTSase -MTHase và phản ứng ở các điều kiện xác định [5, 6]. Ket thúc toàn bộ quá trình, nâng nhiệt độ 95°c trong 10 phút để bất hoạt enzyme. Phân tích hàm lượng đường trehalose tạo thành.
2.3. Phương pháp phân tích
2.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng trehalose
Xác định hàm lượng trehalose theo phương pháp Kit-Trehaiose K-TREH07/17 [7], trehalose được thủy phân và chuyển hóa bởi một loạt phản ứng enzyme (hình 2.1), sản phẩm cuối cùng là gluconate-6-phos- phate và nicotinamide-adenine dinucle- otide phosphate dạng khử (NADPH). Lượng NADPH hình thành trong phản ứng này có hệ số tỉ lượng bằng lượng D-glucoza và gấp hai lần lượng trehalose. NADPH hấp thụ ánh sáng cực tím và xác định hàm lượng trehalose thông qua lượng NADPH bằng đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 340nm.
2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử và đường tống
Xác định hàm lượng đường khử, đường tổng theo phương pháp Miller, 1959 [8], Lấy 5ml dịch mẫu bổ sung H2SO4 6,5%, thuỷ phân 1 giờ ở 1000C. Trung hoà về pH 6,0 bằng Na2CO3 tinh thể. Lấy 0,5ml dịch mẫu bổ sung 0,5ml dung dịch DNS (6,5g 3,5 - dinitro- salicytic axit + 325ml dung dịch 2M NaOH + 45g glycerol hòa tan và định mức với nước cất thành 1000 ml) thủy phân ở 100°c trong thời gian 5 phút, kết thúc phản ứng làm nguội nhanh và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 575nm. Lượng đường khử có trong dịch sau đó được xác định nhờ đường chuẩn gluco- za. Lượng đường tổng được tính theo công thức sau:
TS = RS X 0,88
Trong đó: TS: đường tổng; RS: lượng đường khử có trong dịch phân tích.
III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu điều kiện chuyển tinh bột sắn thành trehalose
3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH
Tinh bột sắn sau khi thủy phân (qua các giai đoạn: xử lý tinh bột, dịch hóa, đường hóa) thu dịch thủy phân chứa maltooli- gosaccharit. Để xác định khoảng pH thích hợp cho quá trình chuyển hóa dịch thủy phân tinh bột sắn thành trehalose, tiến hành ở điều kiện: nồng độ MTSase- MTHase là 200 U/g cơ chất, nồng độ tinh bột sắn ban đầu là 20 g/l, nhiệt độ từ 45 - 650C, pH từ 4,5 - 7,5, thời gian 24 giờ, khuấy 100 vòng/phút, bất hoạt enzyme ở 1000C trong 15 phút. Chỉ tiêu đánh giá là hàm lượng đường trehalose so với đường tổng, kết quả được miêu tả tại hình 1.
Qua đồ thị hình 1 thấy rằng, khi nhiệt độ tăng 40-550C tốc độ phản ứng tăng đạt cực đại tại 550C, sau đó nhiệt độ tăng 60 - 660C lại kìm hãm quá trình chuyển hóa trehalose; pH thích hợp trong khoảng 6,0-6,5. Như vậy, tại nhiệt độ 550C và pH 6,0 lượng trehalose đạt cao nhất khoảng 70,8% so với đường tổng.
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme MTSase -MTHase
Để xác định được một nồng độ enzyme thích hợp, tiến hành thí nghiệm với các điều kiện: nồng độ tinh bột 20 g/l, nhiệt độ 500C, pH 6,0, thời gian 24 giờ. Bổ sung enzyme với tỷ lệ khác nhau từ 100 đến 400 U/g cơ chất, khuấy 100 vòng/phút.
Qua hình 2 thấy rằng: Khi tăng MTSase-MTHase từ 100 U/g đến 300 U/g cơ chất, hiệu suất chuyển hóa trehalose tăng, khi tăng nồng độ enzyme lớn hơn 300 U/g cơ chất hàm lượng trehalose giảm nhiều. Có thể do nồng độ cơ chất tăng đến mức bão hòa thì lúc này tốc độ của phản ứng không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, chất ức chế hoặc chất cảm ứng hoạt động của enzyme. Qua hình 2 thấy rằng việc sử dụng en¬zyme MTSase-MTHase thích hợp ở nồng độ 300 U/g cơ chất. Hàm lượng trehalose được tạo thành đạt 73,7% so với đường tổng.
3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Theo tài liệu của các nghiên cứu trước cho thấy, enzyme MTSase-MTHase hoạt động đồng thời để chuyển hoá đường trehalose và chịu ảnh hưởng rất lớn của nồng độ cơ chất [2, 4]. Để xác định nồng độ cơ chất thích hợp, thí nghiệm được tiến hành với dịch thủy phân tinh bột sắn nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau từ 20% đến 40%, phản ứng ở điều kiện pH 6,0, nhiệt độ 550C, bổ sung enzyme với tỷ lệ MTSase-MTHase 300 U/g cơ chất, khuấy 100 vòng/phút, thời gian 24 giờ. Sau mỗi 4 tiếng mỗi lần lấy mẫu để phân tích hàm lượng đường trehalose và đường tổng.
Hiệu suất chuyển hoá đường trehalose tăng nhanh theo sự tăng của nồng độ cơ chất từ 10-30%, tuy nhiên khi nồng độ cơ chất tăng lên 35% sẽ làm cho môi trường chuyển hoá có độ nhớt quá lớn, hạn chế sự khuếch tán trong dịch, hạn chế sự liên kết giữa cơ chất và enzyme, do đó làm giảm khả năng xúc tác của enzyme. Từ kết quả nghiên cứu ta nhận thấy, nồng độ cơ chất của phản ứng thích hợp nhất 30%, hàm lượng trehalose đạt 76,8% so với đường tổng. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu Itur- riaga cho rằng enzyme xúc tác chuyển hóa maltooligosacharit thành trehalose trong điều kiện nồng độ cơ chất đậm đặc, nếu nồng độ cơ chất thấp, hoạt tính của enzyme sẽ chuyển sang hướng thuỷ phân, sản phẩm thu được khi đó chủ yếu là glucoza và oligosacharit khác [4].
3.2. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất chuyển hóa tinh bột sắn thành trehalose
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme isoamylase
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme isoamylase từ 600-1500 U/g tinh bột, nhiệt độ 550C, pH = 6,0, thời gian 16 giờ. Kết thúc phản ứng xác định trehalose và đường khử tổng. Kết quả phân tích được thể hiện ở hình 3.
Đối với sản xuất trehalose thì isoamylase được ưu tiên sử dụng hơn pu- lullanase do sự hình thành maltose và maltotriose hạn chế, sản phẩm chủ yếu gồm các maltoooligosacharit có mức độ trùng hợp phân tử glucoza lớn hơn 3 sẽ thuận lợi cho quá trình chuyển hóa thành trehalose [9]. Kết quả ở hình 4 cũng thấy rằng khi sử dụng enzyme isoamylase cho quá trình đường hóa đã tăng hàm lượng maltooligosacharit, là cơ chất để MTSase - MTHase chuyển hóa thành treahalose (mẫu đối chứng không sử dụng có kết quả khác biệt). Mặt khác, với nồng độ enzyme isoamylase từ 1000-1500 U/g tinh bột, hiệu quả thủy phân cao hơn tương ứng với các chuỗi glucoza dài hơn trong cơ chất và hàm lượng treahalose thu được đạt >76%, xét về mặt kinh tế chúng tôi lựa chọn sử dụng isoamylase ở nồng độ 1000 U/g tinh bột, hàm lượng trehalose đạt 76,5%.
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme cyclodextrin glycano- transferase
CGTase đã được áp dụng cho quá trình sản xuất để tăng sản lượng của trehalose. Enzyme được bổ sung cùng giai đoạn với quá trình chuyển hóa trehalose. Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme CGTase ở nồng độ 10 U, 15 U, 20 U, 25 U, 30 U/g tinh bột, quá trình dịch hóa, đường hóa và chuyển hóa trehalose ở các điều kiện đã xác định. Kết quả xác định hàm lượng trehalose và đường khử tổng được thể hiện ở hình 5.
Như thể hiện trong hình 5, việc bổ sung CGTase vào hỗn hợp phản ứng đã giảm lượng đường khử và tăng hàm lượng trehalose tạo thành. Ở nồng độ enzyme CGTase 20 U/g tinh bột, hàm lượng trehalose đạt cao nhất 80,4% sau 24 giờ phản ứng.
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời điểm bổ sung enzyme cyclodextrin glycanotransferase
Thời điểm bổ sung CGTase có ảnh hưởng nhiều tới việc tăng năng suất thu nhận trehalose, tiến hành nghiên cứu thời điểm bổ sung CGTase tại 0,4,6,8,10 giờ sau khi phản ứng chuyển hóa trahalose bắt đầu, kết quả phân tích hàm lượng trehalose được trình bày tại hình 6.
Qua hình 6 thấy rằng, thời điểm bổ sung CGTase trong giai đoạn đầu phản ứng không có sự khác biệt nhiều, sau 4-6 giờ phản ứng trehalose tạo thành có tăng so với thời điểm bổ sung ngay ban đầu phản ứng, sau 4 giờ, 6 giờ phản ứng (tăng 2% và 6% tương ứng). Tại thời điểm bổ sung CGTase sau 8 giờ phản ứng hàm lượng trehalose đạt cao nhất là 86,2% (tăng 14% so với so với thời điểm bổ sung ngay ban đầu phản ứng).
Theo các tác giả thì thời điểm bổ sung CGTase phù hợp trong khoảng từ 6-10 giờ sau khi phản ứng chuyển hóa trehalose bắt đầu, thời điểm bổ sung CG- Tase phụ thuộc vào mức độ thủy phân của giai đoạn đường hóa, phụ thuộc vào nồng độ enzyme và cơ chất chuyển hóa trehalose [5, 9].
IV. KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng kết hợp enzyme MTSase-MTHase cùng với isoamylase và CGTase đã tăng hiệu quả tổng hợp trehalose từ tinh bột sắn. Các điều kiện thích hợp: giai đoạn đường hóa (isoamylase nồng độ 1000 U/g tinh bột; nhiệt độ 550C; pH 6,0; thời gian 16 giờ, khuấy 100 rpm); giai đoạn chuyển hóa tổng hợp trehalose (MTSase-MTHase nồng độ 300 U/g tinh bột; nhiệt độ 550C; pH 6,0, bổ sung CGTase sau 8 giờ phản ứng, thời gian 24 giờ). Kết thúc quá trình chuyển hóa hàm lượng trehalose đạt 86,2% so với đường tổng.
Lời cảm ơn: Kết quả thực hiện là một phần kết quả của đề tài ĐT. 03.17/ CNSH CB, kinh phí tài trợ bởi Đề án phát triển và ứng dụng CNSH trong lĩnh vực CN chế biến đến năm 2020.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Thị Minh Hạnh and cộng sự (2006). Báo cáo tổng kết đề tài Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Mã số KC.04.28. Chương trình KH&CN trọng điểm giai đoạn 2005-2010.
2. Burek, M., et al. (2015). Trehalose -properties, biosynthesis and applications. Chemilk. 69(8): p. 469-476.
3. Higashiyama, T (2002). Novel functions and applications of trehalose. PureAppl Chem. 74: p. 1263-1269.
4. Iturriaga, G., R. Suárez, and B. Nova-Franco (2009). Trehalose Me¬tabolism: From Osmoprotection to Signaling. International Journal of Molecular Sciences. 10: p. 3793-3810.
5. Kubota, M., et al. (2004). The Devel-opment of a,a-Trehalose Production and Its Applications. J. Appl. Glyco- sci. 51:p. 63-70.
6. Maruta, K., et al. (1995). Formation of trehalose from maltooligosaccha¬rides by a novel enzymeatic system. Biosci Biotechnol Biochem. 59: p. 1829-1834.
7. Megazyme https://secure.mega-zyme. com/files/BoOKLET/K-TREH_ DATA.pdf.
8. Miller, G.L. (1959). Use of dinitrosa-licylic acid reagent for determination ofreducing sugars. Analytical Chemistry. 31:p. 326-328.
9. Schiraldi, C., I.D. Lernia, and M.D. Rosa (2002). Review: Trehalose pro¬duction: exploiting novel approaches. Trends in Biotechnology. 20(10): p. 420-425.
10. Teramoto, N., N.D. Sachinvala, and M. Shibata (2008). Review Trehalose and Trehalose-based Polymers for Environmentally Benign, Biocompat¬ible and Bioactive Materials. Molecules 13: p. 1773-1816.
RESEARCH ON OPTIMAL CONDITIONS FOR THE CONVERSION AND SYNTHESIS OF TREHALOSE FROM CASAVA STARCH BY EN-ZYMEATIC METHOD
The method of producing trehalose from cassava starch using maltooligosyl trehalose syn-thase (MTSase) andmaltooligosyl trehalose trehalohydrolase (MTHase) was highly effective and could be applied in large-scale production. This research used MTSase and MTHase enzymes obtained from Saccharolobus solfataricus DSM 1616 strain to convert and synthe-size trehalose from cassava starch. Cassava starch solution containing maltooligosaccharide was hydrolyzed under appropriate conditions: optimum pH of 6.0 and temperature of 55oC; MTSase-MTHase at 300U / g starch; adding CGTase after 8 hours of reaction, time of me-tabolism 24 hours. To improve the conversion efficiency of starch into trehalose, hydrolytic enzyme as isoamylase (1000U / g starch) and CGTase enzyme (20U / g starch) were added. The results showed that, after the hydrolysis and conversion of cassava starch by enzyme method, the content of trehalose reached 86.2% of the total sugar. In conclusion, maltooligo- syl trehalose synthase and maltooligosyl trehalose trehalohydrolase could be used to produce trehalose from available cassava starch sources in Vietnam. Keywords: Maltooligosyl trehalose synthase, maltooligosyl trehalose trehalohydrolase, maltooligosaccharit, cassava starch.
|
Đỗ Thị Thanh Huyền1, Nguyễn Mạnh Đạt2, Bùi Thị Hồng Phương3, Đỗ Thị Thủy Lê4, Lê Đức Mạnh5
1ThS. Viện Công nghiệp Thực phẩm, 2TS. Viện Công nghiệp Thực phẩm, 3ThS. Viện Công nghiệp Thực phẩm, 4TS - Viện Công nghiệp Thực phẩm , 5TS. Viện Công nghiệp Thực phẩm
(Bài đăng trên Tạp chí Dinh dưỡng và Thực phẩm, Tập 15 - số 5,6 - tháng 12/2019)
Đăng nhập
