Quá trình sinh tổng hợp protease từ B. subtilis khi sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm (nuôi cấy sâu), pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến sự tổng hợp và tích lũy protease trong môi trường. Tùy vào chủng vi sinh vật sử dụng trong quá trình sinh tổng hợp enzyme khác nhau mà giá trị pH ban đầu sẽ khác nhau.

Kết quả cho thấy, hoạt độ protease thu nhận được khi nuôi cấy trong môi trường pH khác nhau từ 6 đến 8 có sự chênh lệch không đáng kể. Hoạt độ enzyme cao nhất ghi nhận được ở pH 7,5 đạt 0,434 UI/ml (hình 5).

B. subtilis là vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy nghi, vì vậy nồng độ oxy hòa tan trong quá trình nuôi ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Thông thường, đối với các vi khuẩn hiếu khí nồng độ oxy cao làm tăng khả năng sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát. Nồng độ oxy thấp có thể ức chế, làm suy giảm khả năng sinh trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, tùy từng mục đích thí nghiệm và tùy từng chủng vi khuẩn. Trong điều kiện môi trường thiếu oxy sẽ suy giảm khả năng sinh trưởng nhưng có thể kích thích sự sinh tổng hợp enzyme.

Kết quả ở hình 6 cho thấy, hoạt độ protease của chủng B. subtilis Bs04 sinh tổng hợp tỷ lệ thuận với độ thoáng khí trong bình nuôi. Hoạt độ protease cao nhất đạt 0,636 UI/ml khi nuôi cấy trong bình có độ thoáng khí 90%. Với đặc tính là vi khuẩn hiếu khí mạnh nên sự thoáng khí nhiều sẽ kích thích sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protease ở vi khuẩn B. subtilis Bs04. 

Protease thu nhận từ B. subtilis là enzyme ngoại bào được vi sinh vật sinh tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường trong quá trình sinh trưởng. Mỗi thời điểm trong chu kỳ sinh trưởng vi khuẩn sẽ sinh tổng hợp enzyme với nồng độ và hoạt độ khác nhau. Nếu thu nhận enzyme quá sớm, nồng độ và hoạt độ enzyme sẽ thấp. Ngược lại, nếu kéo dài thời điểm thu nhận enzyme thì lượng enzyme tiết ra môi trường quá nhiều sẽ ảnh hưởng lẫn nhau và enzyme chịu tác động của các yếu tố môi trường bên ngoài sẽ làm giảm hoạt độ hay phá hủy cấu trúc tự nhiên của enzyme. Qua hình 7 cho thấy, hoạt độ protease cao nhất được thu nhận tại thời điểm 36 giờ sau nuôi cấy (đạt 0,31 UI/ml).

Sau khi thu nhận dịch protease thô từ canh trường nuôi cấy, tiến hành sử dụng các dung môi ethanol, aceton và muối ammonium sulfate nhằm tủa protease ngoại bào từ dịch enzyme thô.

Kết quả cho thấy, khi tủa bằng dung môi hữu cơ hiệu quả tốt nhất khi sử dụng tỷ lệ 1:4 (v/v) với ethanol và 1:3 (v/v) với acetone. Hoạt độ protease thu nhận được lần lượt là 0,722 UI/ml và 0,675 UI/ml (hình 8). Đối với phương pháp tủa bằng (NH4)2SO4, hiệu quả cao nhất khi sử dụng nồng độ 70% bão hòa, hoạt độ enzyme sau khi thẩm tách đạt 0,874 UI/ml (hình 9). Từ kết quả hình 8 và hình 9 cho thấy, sử dụng muối (NH4)2SO4 tủa protease từ dịch enzyme thô cho hiệu quả tốt hơn sử dụng ethanol và acetone. Nồng độ muối (NH4)2SO4 70% bão hòa cho hiệu quả tốt nhất.

Sau khi thu nhận protease, tiến hành điện đi SDS-PAGE nhằm xác định kích thước protease thu nhận. Qua hình 10 cho thấy, ở các giếng 2 đến giếng 7, dịch enzyme thô và enzyme sau khi tủa đều có sự hiện diện của băng protein với kích thước khoảng 24 kDa và 38 kDa. Qua đó cho thấy, trong nghiên cứu này đã thu nhận được protease ngoại bào của B. subtilis với kích thước 24 kDa và 38 kDa.

Vi khuẩn B. subtilis có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau trong quá trình sinh trưởng như: amylase, protease, levansucrase, RNase, phosphotase kiềm [9]… Trong quá trình lên men chìm, sự sinh tổng hợp protease chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần dinh dưỡng và chất cảm ứng bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Tùy vào đặc tính của từng chủng vi khuẩn sử dụng trong quá trình thí nghiệm và điều kiện nuôi biểu hiện mà nhu cầu về các thành phần dinh dưỡng sẽ khác nhau trong quá trình sinh tổng hợp enzyme. Trong nghiên cứu này, quá trình tổng hợp protease từ vi khuẩn B. subtilis Bs04 được cảm ứng bởi casein, nguồn carbon và nitơ tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp protease từ chủng Bs04 được ghi nhận là glucose-anhydrous và cao nấm men với nồng độ lần lượt là 2,5% và 2% (w/v). Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu trước đó khi thí nghiệm trên chủng B. subtilis MTCC 441 và chủng Bacillus sp. [3, 10]. Tuy nhiên, tùy mỗi chủng vi khuẩn Bacillus sp. khác nhau được phân lập và sử dụng thì nhu cầu phù hợp về thành phần dinh dưỡng có thể sẽ khác nhau. Một số nguồn carbon và nitơ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp protease phổ biến đã được báo cáo như: glucose, galactose, pepptone, cao thịt bò [11-13]... Nhìn chung, bổ sung vào môi trường nuôi nguồn dinh dưỡng (carbon, nitơ) hữu cơ cho thấy hiệu quả hơn nguồn vô cơ vì sự đa dạng của các amino acid [2, 5, 12, 13]. Protease thu nhận từ B. subtilis trong quá trình lên men chìm có thể thu nhận được ở dãy pH rộng từ 6 đến 11. Trong nghiên cứu này, pH 7,5 được ghi nhận phù hợp nhất trong quá trình sinh tổng hợp protease từ chủng Bs04. Một số điểm pH phù hợp khác đối với từng chủng B. subtilis đã được báo cáo như pH 7, pH 10-11 [12, 13]…

Dịch chiết enzyme thô thu nhận từ chủng Bs04 có hoạt độ 0,7 UI/ml. Kết quả này tương đương với một số nghiên cứu đã được báo cáo như: ứng dụng Bacillus trong xử lý phế phụ phẩm cá tra, hoạt độ protease được ghi nhận 0,012 UI/mg [14] và 1,15 UI/ml [15]; hay protease được tổng hợp từ Bacillus phân lập từ lò giết mổ đạt 0,7 UI/ml [16]. Tuy nhiên, so sánh với một số nghiên cứu khác trên thế giới, hoạt độ protease trong nghiên cứu này vẫn còn tương đối thấp. Một số nghiên cứu điển hình thu nhận protease hoạt độ cao đạt 20,2 UI/ml [5] hay hoạt độ protease đạt 86 UI/ml [17]... Kết quả này có thể do chủng vi khuẩn Bs04 được thu nhận tại khu vực không phải là nơi tối ưu nhất cho hoạt tính sinh protease (từ nguồn đất vườn).

Kích thước protease ngoại bào thu nhận từ B. subtilis từ 20-95 kDa tùy vào từng chủng vi khuẩn khác nhau. Trong nghiên cứu này, protease thu nhận từ dịch chiết enzyme thô có kích thước 24 kDa và 38 kDa. Kích thước protease từ một số báo cáo khác được ghi nhận như 32 kDa, 49 kDa, 30,9 kDa, 75 kDa [12, 13, 18, 19]…

Chủng B. subtilis Bs04 trong nghiên cứu này cho thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường chứa nguồn carbon và nitơ lần lượt  là glucose-anhydrous và cao nấm men với nồng độ tương ứng 2,5% và 2%. Môi trường lên men với pH 7,5 và thời điểm thu nhận enzyme cho hoạt độ cao sau 36 giờ lên men. Enzyme protease thô được thu nhận theo phương pháp ly tâm với hoạt độ đạt 0,7 UI/ml. Kết quả tủa enzyme cho thấy hiệu quả nhất khi sử dụng muối (NH4)2SO4 ở độ bão hòa 70%. Protease thu nhận được có kích thước 24 kDa và 38 kDa.

Việc tối ưu các thành phần dinh dưỡng, điều kiện lên men giúp cải thiện đáng kể khả năng sinh tổng hợp protease từ chủng vi khuẩn B. subtilis Bs04. Điều này mở ra tiềm năng trong quá trình sản xuất protease từ chủng phân lập thực địa.