Ảnh hưởng của thể tích bình nuôi: hỗn hợp 2 chủng (không đối kháng nhau khi nuôi cấy chung) được nuôi ở lọ penixilin 13 ml, bình duran và túi nilon 1 lít, 5 lít trên các môi trường tương ứng.
Sản xuất sinh khối trong bình duran và túi nilon hình trụ thể tích 5 lít: hỗn hợp 2 chủng được nuôi trong bình thuỷ tinh duran với 50% môi trường BTH và trong túi nilon (10 túi) với 100% môi trường BTH. Các túi được đặt xung quanh đèn sợi đốt với khoảng cách 30 cm từ đèn đến các túi nuôi vi khuẩn và có khuấy đảo bằng khuấy từ (bình duran) và bơm ngầm (túi nilon).
Sản xuất sinh khối VKTQH trong bể thủy tinh hình hộp chữ nhật thể tích 1m3: hỗn hợp 2 chủng được nuôi trong 25% môi trường BTH trong bể thuỷ tinh hình hộp chữ nhật 1m3 đậy kín bằng kính và được đặt ngoài tự nhiên dưới ánh sáng mặt trời, buổi tối có chiếu đèn bổ sung (200 W) và có khuấy đảo bằng bơm ngầm. Thí nghiệm được tiến hành vào 4 đợt trong 2 tháng (tháng 9 và tháng 10), nhiệt độ phòng nuôi dao động từ 25-350C.
Xác định chỉ số COD: bằng phương pháp dicromat, TCVN 6491:1999 [7], tiến hành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Xác định hàm lượng lipid tổng số: theo phương pháp Bligh và Dyer (1959) [1].
Xác định thành phần và hàm lượng axít béo: theo phương pháp ISO/FDIS 5509:1998 [8], tiến hành tại Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả biểu diễn ở dạng TB ± SD. Tính toán số liệu và vẽ đồ thị được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel phiên bản 2010. So sánh trung bình giữa nghiệm thức dựa vào phương pháp ANOVA ở mức ý nghĩa α = 0,05.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của hình dạng và thể tích bình nuôi đến khả năng tích luỹ sinh khối
VKTQH thuộc nhóm vi sinh vật quang dưỡng, chúng cần ánh sáng cho sinh trưởng. Do vậy, hình dạng và thể tích bình nuôi có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tích luỹ sinh khối của chúng. Ảnh hưởng của thể tích và hình dạng bình nuôi đến khả năng tích luỹ sinh khối của hỗn hợp 2 chủng HPB.6 và VTN.2 sau 8 ngày nuôi được thể hiện trên Hình 1. Có thể thấy khả năng tích luỹ sinh khối tại các bình, túi có cùng thể tích nhưng có hình dạng khác nhau cho kết quả khác nhau. Khi nuôi trong túi nilon hình trụ thể tích 1 lít và 5 lít khả năng tích luỹ sinh khối cao ΔOD800 đạt 5,95 ± 0,41 và 5,80 ± 0,22 tương ứng, sau 5 ngày nuôi, cao gấp 1,5-1,9 lần so với nuôi trong bình duran 1 lít và 5 lít. Ngoài ra, thời gian để sinh khối đạt cực đại cũng rút ngắn hơn từ 1-2 ngày.
Khi so sánh việc nuôi cấy vi khuẩn tại các bình có hình dạng tương đương (hình trụ) nhưng khác nhau về thể tích (5 lít, 1 lít, 13 ml) cho thấy khả năng tích luỹ sinh khối đạt cao nhất ở bình có thể tích bé nhất, tức là trong lọ penixilin (13 ml) khi ΔOD800 đạt đến 6,07 ± 0,52 sau 4 ngày nuôi. Ở bình duran 1 lít và 5 lít khả năng tích luỹ sinh khối đạt 65,1 % sau 7 ngày nuôi và 50,3 % sau 8 ngày nuôi tương ứng.
Hình 1. Khả năng sinh trưởng (theo ΔOD800) của hỗn hợp 2 chủng trong các bình nuôi với các thể tích khác nhau Tuy nhiên, để sản xuất sinh khối cho các mục đích thực tiễn lại không thể nuôi trong các thiết bị nuôi cấy nhỏ. Vì vậy, nồng độ, độ đậm đặc môi trường, hình dạng thiết bị nuôi cấy là những yếu tố được nghiên cứu để tăng cường sinh trưởng, gia tăng khả năng tích lũy sinh khối của VKTQH. Các kết quả nghiên cứu về nồng độ môi trường không được trình bày chi tiết trong bài báo này.
III. SẢN XUẤT SINH KHỐI VKTQH THEO MÔ HÌNH FED-BATCH
Nuôi trong bình duran thể tích 5 lít
Nhằm thu được lượng sinh khối cao sử dụng làm nguyên liệu cho tách chiết dầu sinh học giàu axít béo không no (dạng omega 3,6,7,9), trong thí nghiệm này đã sử dụng phương pháp nhân nuôi theo kiểu fed-batch (lần 1, lần 2) và so sánh với phương pháp nhân nuôi theo mẻ (Hình 2). Các kết quả này cho thấy đường cong sinh trưởng của hỗn hợp 2 chủng nuôi trong bình 5 lít (nuôi theo mẻ) đạt pha cân bằng sau 5 ngày nuôi cấy và hàm lượng chất dinh dưỡng giảm (COD từ 3.400 ± 360 mg/l xuống 775 ± 82mg/l).
Khảo sát thời điểm bổ sung cơ chất cho thấy khả năng tích lũy sinh khối cao nhất khi bổ sung cơ chất vào ngày thứ 4 (sau 7 ngày nuôi, ΔOD800: 4,58 ± 0,38). Khả năng này giảm khi bổ sung vào ngày thứ 3 (chỉ đạt 88% sau 7 ngày nuôi, ΔOD800: 4,03 ± 0,21) hoặc vào ngày thứ 5 (đạt 81,88% sau 8 ngày nuôi, ΔOD800: 3,75 ± 0,17) so với sinh trưởng khi bổ sung cơ chất vào ngày thứ 4. Có thể khi bổ sung môi trường sớm (vào ngày thứ 3) khi VKTQH chưa đủ mật độ cần thiết hoặc vào ngày thứ 5 khi VKTQH đã ở pha cân bằng nên mật độ giảm, tế bào đã già nên khả năng sinh trưởng không cao như khi bổ sung môi trường vào ngày thứ 4. Từ kết quả của thí nghiệm trên, chọn ngày thứ 4 để bổ sung môi trường nuôi (fed-batch) do đây là thời điểm không chỉ tiệm cận với sự tích luỹ sinh khối cực đại mà tế bào vi khuẩn vẫn đang ở giai đoạn log của quá trình sinh trưởng nên khả năng sinh trưởng cao hơn.
Sau 3 ngày bổ sung môi trường (tức 7 ngày nuôi cấy) khả năng tích luỹ sinh khối đạt pha cân bằng (ΔOD800: 4,58 ± 0,38) tăng 183,9% so với nuôi theo mẻ (5 ngày). Ngoài ra hàm lượng chất dinh dưỡng còn lại (theo COD) là 464 ± 30 mg/l. Tiếp tục bổ sung môi trường nuôi vào ngày thứ 6 (fed-batch lần 2) khả năng tích luỹ sinh khối tăng không đáng kể (ΔOD800 đạt 5,48 ± 0,34) và chỉ tăng 119,6% so với fed-batch lần 1. Nguyên nhân có thể là do lúc này hàm lượng chất dinh dưỡng của môi trường, cùng với sự tích luỹ sinh khối của VKTQH tạo nên sự đậm đặc của môi trường nuôi cấy tạo ra hiệu ứng cản quang làm ảnh hưởng tới khả năng tiếp nhận ánh sáng, qua đó, ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, tích luỹ sinh khối của vi khuẩn.
Nuôi trong túi nilon hình trụ thể tích 5 lít
Kết quả nghiên cứu sản xuất sinh khối trong túi nilon hình trụ thể tích 5 lít được thể hiện trên hình 3.
Từ hình 3 cho thấy nuôi trong túi nilon 5 lít (nuôi theo mẻ) sinh trưởng của VKTQH đạt pha cân bằng (ΔOD800: 5,77 ± 0,46) sau 5 ngày nuôi cấy và hàm lượng chất dinh dưỡng giảm (COD giảm từ 6.700 ± 310 mg/l xuống 410 ± 47 mg/l). Thời điểm bổ sung cơ chất vào ngày thứ 4 tích lũy sinh khối cao nhất (sau 7 ngày nuôi, đạt ΔOD800: 8,82± 0,91). Khả năng này giảm khi bổ sung vào ngày thứ 3 đạt 87,98% (sau 7 ngày nuôi, ΔOD800: 7,76 ± 0,53) và ngày thứ 5 đạt 80,04 % (sau 8 ngày nuôi, ΔOD800: 7,06 ± 0,84) so với sinh trưởng khi bổ sung cơ chất vào ngày thứ 4. Từ kết quả này, chọn ngày thứ 4 để bổ sung môi trường nuôi fed-batch. Kết quả sau 3 ngày bổ sung môi trường (tức 7 ngày nuôi cấy) khả năng tích lũy sinh khối đạt pha cân bằng (ΔOD800: 8,82 ± 0,91) tăng 152,9% so với nuôi theo mẻ (5 ngày). Ngoài ra, hàm lượng chất dinh dưỡng còn lại (theo COD) là 1.905 ± 133 mg/l. Việc bổ sung môi trường (fed-batch) lần 2 là không cần thiết do hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường còn khá cao (COD còn lại 1.905 ± 133 mg/l). Như vậy, sử dụng túi nilon hình trụ và phương pháp nuôi fed-batch để sản xuất sinh khối VKTQH cho hiệu quả cao ΔOD800 đạt 8,82 ± 0,91 tương ứng 7,58 ± 0,54 g/l sau 7 ngày nuôi cấy.
Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp nuôi trong túi nilon là chi phí đầu tư cho thiết kế, sản xuất, lắp đặt hệ thống và vận hành cao nếu sản xuất ở quy mô lớn. Ngoài ra, đặc điểm của nhóm VKTQH là hướng quang nên chúng có hiện tượng bám thành túi mặc dù đã sử dụng bơm ngầm để khuấy trộn (giúp vi khuẩn tiếp xúc tốt với môi trường và giảm thiểu khả năng bám thành). Do vậy, chi phí nhân công cho việc vệ sinh thiết bị sau mỗi mẻ nhân nuôi là rất cao. Để khắc phục tình trạng trên các bình, bể nuôi thiết kế theo hướng đơn giản, dễ thao tác và vận hành được sử dụng để sản xuất sinh khối quy mô lớn.
Sản xuất sinh khối VKTQH trong bể kính hình hộp chữ nhật thể tích 1 m3
Kết quả nghiên cứu sản xuất sinh khối trong bể kính hình hộp chữ nhật thể tích 1 m3 được thể hiện trên Hình 4.
Từ hình 4 cho thấy sinh trưởng của hỗn hợp 2 chủng (nuôi theo mẻ) đạt pha cân bằng (ΔOD800: 1,56 ± 0,13) sau 5 ngày nuôi cấy và hàm lượng chất dinh dưỡng giảm (COD từ 1.690 ± 123 mg/l xuống 135 ± 25 mg/l). Thời điểm bổ sung cơ chất ảnh hưởng tới khả năng tích lũy sinh khối. Sinh khối đạt cao nhất khi bổ sung cơ chất vào ngày thứ 4 (ΔOD800: 2,95 ± 0,34 sau 8 ngày nuôi) và giảm khi bổ sung vào ngày thứ 3 đạt 89,83% (ΔOD800: 2,65 ± 0,17 sau 8 ngày nuôi) và ngày thứ 5 đạt 85,76% (ΔOD800: 2,53± 0,21 sau 9 ngày nuôi) so với sinh trưởng khi bổ sung cơ chất vào ngày thứ 4. Từ kết quả này, chọn ngày thứ 4 để bổ sung môi trường nuôi (fed-batch). Sau 4 ngày bổ sung môi trường (tức 8 ngày nuôi cấy) khả năng tích luỹ sinh khối đạt pha cân bằng tương ứng với 2,42 ± 0,29 g/l tăng 189,1% so với nuôi theo mẻ (5 ngày) và hàm lượng chất dinh dưỡng còn lại (theo COD) là 123 ± 20 mg/l. Ở thời điểm này, hàm lượng cũng như chất lượng sinh khối (thành phần axít béo) đạt được là cao nhất cũng như hạn chế tối đa chất dinh dưỡng còn lại sau mỗi mẻ nhân nuôi. Kết quả này tương đương với kết quả của Johannes F., Imhoff và Bernhard T. [5].
Ở quy mô 1m3 với các thiết bị nhân nuôi đơn giản, dễ thao tác sử dụng nhưng khó có thể đảm bảo điều kiện nuôi cấy là kỵ khí tuyệt đối nên khả năng tạp nhiễm vi khuẩn ngoại lai là rất lớn. Do vậy, phương pháp fed-batch bổ sung môi trường nuôi vào ngày thứ 4 và thu hoạch sinh khối vào ngày thứ 8 khi sử dụng bể kính hình hộp chữ nhật thể tích 1m3 là sự lựa chọn phù hợp. Sinh khối thu được có hàm lượng lipid trong bể 1m3 đạt 20,342 ± 1,247% (KLK) và hàm lượng omega 3,6,7,9 đạt 8,482; 4,096; 18,318 và 25,387% tổng axít béo (kết quả chi tiết không trình bày tại bài báo này).
Mặc dù sử dụng túi nilon để nuôi cấy cho kết quả sản xuất sinh khối VKTQH khá cao. Tuy nhiên, không thể sử dụng do kỹ thuật và giá thành, chi phí nhân công. Do vậy, lựa chọn thiết bị nuôi là bể kính hình hộp chữ nhật thể tích 1m3 và sử dụng 25% môi trường BTH là lựa chọn phù hợp dù sinh khối thu được thấp hơn so với sản xuất trong túi nilon. Bù lại, lượng dinh dưỡng tiêu thụ thấp và sinh khối thu được đảm bảo chất lượng làm nguyên liệu để tách chiết dầu sinh học giàu axít béo không no (omega 3,6,7,9).
KẾT LUẬN
Hình dạng và kích thước bình nuôi có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tích luỹ sinh khối VKTQH. Khả năng tích luỹ sinh khối cao gấp 1,5-1,9 lần và thời gian nuôi ngắn hơn (1-2 ngày) khi sử dụng vật liệu nuôi bằng túi nilon (1 lít, 5 lít) so với sử dụng bình duran (1 lít và 5 lít) tương ứng.
Sản xuất sinh khối VKTQH theo mô hình nuôi cấy fed-batch tại ngày nuôi thứ 4 cho thấy sinh trưởng (theo ΔOD800) trong bình 5 lít (sử dụng 50% môi trường BTH); túi nilon 5 lít (sử dụng 100% môi trường BTH) đạt 4,58 ± 0,38; 8,82± 0,91; và 2,95 ± 0,48 tương ứng.
Sử dụng bể kính hình hộp chữ nhật, thể tích 1m3 (với 25% môi trường BTH) để nuôi cấy, sản xuất sinh khối VKTQH theo mô hình fed-batch ở ngày thứ 4 làm nguyên liệu tách chiết dầu sinh học giàu omega 3,6,7,9 là mô hình thiết bị phù hợp nhất. Trong mô hình này, sinh khối khô của VKTQH thu được sau 8 ngày nuôi đạt 2,42 ± 0,29 g/l, hàm lượng lipid đạt 20,342 ± 1,247 % KLK. Hàm lượng omega 3,6,7,9 đạt 8,482; 4,096; 18,318 và 25,387 % so với axít béo tổng số.
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 trong đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất omega 6, 7, 9 từ vi khuẩn tía quang hợp ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm”, mã số: ĐT.09.17/CNSHCB.
TÀI LIỆU THAM KHẢO.
1. Bligh E. G., Dyer W. J., (1959), A rapid method of total lipid extraction and purification, Can J Biochem Physiol 37: 911-917.
2. Carlozzi P., Seggiani M., Cinelli P., Mallegni N., Lazzeri A. (2018), Photofermentative Poly-3-Hydroxybutyrate Production by Rhodopseudomonas Sp. S16-VOGS3 in a Novel Outdoor L-Shaped Row Photobioreactor. Sustainability, 10: 3133.
3. Hoang Thi Yen, Tran Thị Thu Quynh, Chu Hoang Ha, Do Thi Tuyen, Dang Tat Thanh, Dinh Thi Thu Hang (2019), Identification and characterization of a purple nonsulfur bacterium isolated from coastal area of Hai phong producing unsaturated fatty acid (omega 6, 7, 9), Vietnam Journal of Science and Technology, 57 (6) 665-676.
4. Imhoff J.F., Hiraishi A., and Suling J., (2005), Anoxygenic phototrophic purple bacteria, Bergey’s manual of Systematic Bacteriology, George M.Garrity 2: 1-41.
5. Johannes F., Imhoff and Bernhard T., (1991), Influence of salt concentration and temperature on the fatty acid compositions of Ectothiorhodospira and other halophilic phototrophic purple bacteria, Arch Microbiol. 156: 370-375.
6. Kim D.H., Lee J. H., Hwang Y., Kang S., Kim M. S., (2013), Continuous Cultivation of Photosynthetic Bacteria for Fatty Acids Production, Bioresource Technol. 148: 277- 82.
7. TCVN 6491:1999, Chất lượng nước - Xác định nhu cầu oxy hóa học.
8. Tiêu chuẩn ISO/FDIS 5509:1998, LB Đức.
Hoàng Thị Yến1 - Trần Thị Thu Quỳnh1, Đinh Thị Thu Hằng2
1 Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2 Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Theo Bản tin KHCN ngành Công Thương, số tháng 6 năm 2020
Đăng nhập
