Chủ nhật, 20/06/2021 | 13:05

Chủ nhật, 20/06/2021 | 13:05

Bài báo khoa học

Cập nhật 01:54 ngày 28/02/2020

Đánh giá khả năng loại nhựa của một số chủng nấm phân lập ở Việt Nam

1. ĐẶT VẤN ĐÊ
Hiện nay nước ta có hai doanh nghiệp sản xuất giấy có công suất lớn là Tổng công ty Giấy Việt Nam (Vinapaco) và Công ty cổ phần Giấy An Hòa. Nhà máy Giấy Bãi Bằng sử dụng công nghệ nấu sunfat gián đoạn và công ty CP Giấy An Hòa áp dụng công nghệ nấu liên tục với dây chuyền thiết bị mới, nhưng cặn nhựa vẫn gây ra nhiều khó khăn (gây cáu cặn đường ống, tắc lưới lọc dịch trong nồi nấu liên tục v.v...). Một số giải pháp đã được áp dụng trong bảo quản dăm mảnh, bổ sung chất trợ phân tán trong quá trình nấu bột v.v..., nhưng vẫn chưa đem lạl hiệu quả thực sự.
Xu hướng mới hiện nay là đưa vi sinh vật phân hủy nhựa và enzym vào công đoạn tiền xử lý nguyên liệu gỗ và trong quá trình sản xuất bột giấy đế giảm lượng hóa chất bổ sung, giảm cặn nhựa và giảm áp lực xử lý nước thải.
Trên thế giới, hiện nay đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm sinh học và enzym đế loại nhựa cây, giúp quá trình sản xuất giấy hiệu quả và thân thiện môi trường hơn. Một số chế phẩm enzym đã được thương mại hóa như nhóm Resinase, Lipadase, Buzyme được sử dụng để loại bỏ nhựa trong bột giấy và xơ sợi. Trên thị trường quốc tế hiện có chế phẩm Cartapip (New Zealand) có chúa chủng nấm Ophitoma piliterum, được sử dụng chủ yếu đế loại bỏ nhựa cây trong nguyên liệu dăm mảnh gỗ mềm. Các nghiên cứu loại bỏ nhựa đối với gỗ keo là nguyên liệu chính trong sản xuất giấy của Việt Nam thì hầu như chua có. với chủ trương phát triển của ngành công nghiệp giấy nước nhà và nhu cầu sử dụng chế phẩm vi sinh đế loại bỏ nhựa cây trong nguyên liệu dăm mảnh phục vụ sản xuất bột giấy và xuất khẩu cần thiết phải nghiên cứu tuyến chọn các chủng nấm có khả năng loại nhựa tốt đế phục vụ tạo chế phẩm sinh học.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Vật liệu nghiên cứu
Các chủng nấm có trong Bộ sưu tập giống từ của Phòng Vi sinh vật đất, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm KH&CN Việt Nam và các mẫu nấm phân lập từ Nhà máy Giấy Bãi Bằng (Phú Thọ) và Nhà máy Giấy Mục sơn (Thanh Hóa).
Nguyên liệu dăm mảnh keo được chặt mảnh từ gỗ tươi tại Phân xưởng nguyên liệu - Nhà máy Giấy Bãi Bằng- Tổng Công ty Giấy Việt Nam.
2.2.Phương pháp nghiên cứu
Phân lập nấm:
Đối với mẫu nấm có quả thể, dùng dao vô trùng cắt một mẩu nhỏ quả thể gần vào nắp đĩa petri bằng vaselin sao cho mặt dưới của quả thể nơi bào tử bắn ra hướng xuống đĩa thạch môi trường cao malt. Đối với mẫu nấm không hình thành quả thể, mọc lan bám vào thân gỗ, dùng que cấy vô trùng lấy một ít mẫu nấm đó cấy trực tiếp vào đĩa thạch. Các mẫu được nuôi ở 28°c và quan sát trong 2-7 ngày. Các khuẩn lạc nấm được tách, làm sạch và giữ giống.
Nuôi cấy trong môi trường lỏng
Thực nghiệm được tiến hành trên bình nón dung tích 250ml với l,5g bột gỗ keo và bạch đàn được nghiền nhỏ và 75ml môi trường Czapek. Các bình gỗ sau khi được khử trùng ở 121°c trong 30 phút, được làm nguội về nhiệt độ phòng, tiến hành bổ sung giống nấm. Sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C với tốc độ lắc 150 vòng/phút, lọc thu dịch nuôi cấy.
Phương pháp xác định hoạt lực enzym:
+ Hoạt lực Laccase được xác định theo Brakova và cộng sự (2016)
+ Hoạt lực sterol esterasse được xác định theo Rueda và cộng sự (2002).
Tiền xử lý dăm mảnh gỗ với nấm
Dăm mảnh gỗ keo và bạch đàn được chặt với kích thước 1-2 cm2 và xông hơi trong 15 phút. 1 kg dăm gỗ xông hơi được cho vào các túl ni lông và bổ sung 10 ml dịch huyền phù nấm có chứa (106 tẽ bào). Mỗi thí nghiệm được lặp lạl 2 lần và ủ ở nhiệt độ thường với độ ẩm 60% (v/w) trong 20 ngày. Mẫu đối chứng được xử lý tương ứng bằng nước khử trùng. Sau quá trình ủ, xác định hoạt tính enzym, khả năng loại nhựa, sự thất thoát cellulose thông qua quá trình nấu bột sunfat.
Xác định hàm lượng các chất trích ly trong axeton:
Dăm mảnh gỗ keo sau khi được nuôi cấy, được chẻ mảnh và nghiền thu bột gỗ có kích cỡ 0,34-0,4 mm. Mẫu bột gỗ được để đồng ẩm sau đó xác định hàm lượng các chất trích ly. Cho mẫu vào bộ Soxhlex cùng với 150 ml axeton. Đặt bộ Soxhlex vào bếp cách thủy và điều chỉnh nhiệt độ đế số lần trích ly không nhỏ hơn 24 lần trong thời gian 4-5 giờ. Lấy bình chứa dung dịch trích ly ra khỏi Soxhlex và thu hồi axeton bằng phương pháp chưng cất. Sau khi thu hồi xong axeton, dùng nước cất rửa sạch bên ngoài bình chứa dung dịch trích ly rồi mang đi sấy ở 105 ± 3°c trong thời gian 1 giờ. Đặt bình chứa dung dịch chất trích ly vào bình hút ẩm đế nguội và cân chính xác tới 0,1 mg. Thí nghiệm trắng: đế 150 ml dung môi bay hơi tới khô và tiến hành cân chính xác tới 0,1 mg. Hiệu chỉnh khối lượng chất trích ly với khối lượng cân được trong thí nghiệm trắng.
Hàm lượng các chất trích ly được tính theo công thức sau:
Trong đó:
+ wc: khối lượng chất trích ly.
+ wb: Khối lượng chất trích ly còn lại trong thí nghiệm trắng (g).
+ wp: Khối lượng mẫu thử khô tuyệt đối (g).
3. KẾT QUẢ VÀTHẢO LUẬN
Phân lập các chủng nấm có khả năng phân hủy nhựa cây
Từ 116 chủng nấm (100 chủng phân lập thông qua 4 đợt lấy mẫu (ở Bãi Bằng và Mục sơn) và 16 chủng nấm trong bộ sưu tập của Phòng Vi sinh vật đất), đã chọn được 85 chủng thế hiện khả năng sinh tổng hợp laccase (tạo vòng nâu đỏ xung quanh khuẩn lạc trên môi trường đặc hiệu có bổ sung guaiacol (440 pl/L) cho các nghiên cứu tiếp theo. (Hình 1, 2)
Đánh giá hoạt tính sterol esterase và laccase
Nhằm đánh giá hoạt tính laccase và sterol esterase (hai enzyme quan trọng trong phân hủy nhựa cây), các chủng nấm được nuôi cấy trong môi trường Czapek có bổ sung bột gỗ trong thời gian là 14 ngày.
Hầu hết các chủng nấm mục trắng (58 chủng) đều sinh trưởng ở mức trung bình và sinh tổng hợp laccase trên môi trường Czapek bổ sung bột gỗ sau 14 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, khả năng sinh laccase của các chủng khác nhau đáng kế. Chỉ có một số chủng như TĐ16, P. chrysoporium, MS8, MS4, p. eryngii (PE), p. ostreatus N (PON), Coprinus comatus (CC), BBN8, BB29, 2H, H1.2, KI, B73.1 va c. subvermispora 1 và c. subvermispora 2 đạt hoạt tính laccase cao (> 50 nkat/mL). Hai chủng nấm gỗ O. piliferum (OP1 và OP2) sinh tổng hợp laccase khá thấp, lần lượt đạt 11,78 và 14,5 nkat/mL. Hoạt tính sterol esterase của các chủng nấm mục trắng dao động trong khoảng từ 200 - 1000 U/L. Các chủng có khả năng sinh sterol esterase cao (> 1000 U/L) là các chủng nấm mục trắng P. chrysoporium, D. squalens, TĐ25, TĐ36, TĐ95, MS2, BBK8 cùng với hai chủng nấm dát gỗ O. piliferum (OP và OP2).
Các chủng nấm mốc (58 chủng) đều sinh trưởng khá nhanh trên môi trường Czapek bổ sung bột gỗ nhưng khả năng sinh tổng hợp laccase sau 14 ngày nuôi cấy là không cao, phần lớn các chủng có hoạt tính laccase từ 10 - 50 nkat/mL. Bốn chủng có hoạt tính laccase >50 nkat/mL là B6, B21, B28 và B30 còn lại các chủng đều có hoạt tính thấp hoặc không có. Hoạt tính sterol esterase của các chủng nấm mốc chênh lệch nhau khá nhiều, dao động từ 200 - 6000 U/L. Những chủng có hoạt tính sterol esterase cao nhất (> 6000 U/L) là B21, MS4.1, M4.3 và BBK12.
Bên cạnh đó, các chủng nấm sử dụng trong tiền xử lý dăm mảnh phải đảm bảo không hoặc ít phân hủy cellulose. Kết hợp giữa hoạt tính của ba enzyme (laccase, esterase và cellulose) 32 chủng nấm được lựa chọn nuôi cấy trên dăm mảnh đế thử nghiệm khả năng loại nhựa.
Khả năng sinh trưởng và làm giảm nhựa của các chủng nấm trên dăm gỗ keo.
32 chủng nấm được tiến hành kiếm tra khả năng sinh trưởng, loại nhựa trên dăm mảnh keo đã được khử trùng bằng xông hơi. Kết quả cho thấy, các chủng nấm mục trắng sau 2 - 4 ngày có khả năng thích nghi và sinh trưởng trên dăm mảnh gỗ khá chậm, sau đó mới bắt đầu sinh trưởng và phát triển nhanh. Sau khi tiền xử lý với các chủng nấm mục trắng, dăm mảnh gỗ keo đều có màu sáng hơn và mềm hơn nhiều so với ban dầu, với các chủng nấm dát gỗ, dăm mảnh gỗ chỉ sáng hơn và mềm hơn một chút. Các chủng nấm mốc có khả năng sinh trưởng rất nhanh trên dăm mảnh gỗ keo, ăn lan đều trên đống ủ nhưng chỉ sau 15 - 21 ngày, nấm thường sinh trưởng chậm lại, có hiện tượng lụi đi, làm tối màu gỗ, không làm gỗ mềm hơn.
Trích ly hàm lượng nhựa cho thấy, phần lớn các chủng nấm được sử dụng đều có khả năng làm giảm hàm lượng nhựa có trong gỗ keo trên 30%. Các chủng nấm mục trắng và hai chủng nấm dát gỗ có hiệu suất loại nhựa trung bình cao hơn các chủng nấm mốc. Kết quả phân tích hàm lượng nhựa này khá tương đồng với kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym phân hủy nhựa cây của các chủng nấm. Tức là những chủng có khả năng sinh trưởng nhanh, ăn lan tốt trên gỗ và sinh tổng hợp laccase và sterol esterase cao thì cũng có hiệu quả loại nhựa cao và ngược lại. Các chủng nấm mốc có tốc độ sinh trưởng nhanh trên gỗ nhưng lại làm tối màu gỗ, hoạt lực enzym phân hủy nhựa cây và hiệu suất loại nhựa không cao bị loại bỏ. (Bảng 1,2)
Từ kết quả trên 16 chủng nấm (15 chủng nấm mục trắng và OP2) có khả năng làm giảm hàm lượng nhựa từ 50 % trở lên được lựa chọn và thử nghiệm sinh trưởng trên đống ủ 15 kg, mảnh gỗ tươi không xông hơi. Kết quả cho thấy, chỉ có chủng B68, BBN8 và OP2 là có thế sinh trưởng tốt trên đống ủ này. (Hình 3)
Đặc điếm của các chủng nấm B68, BBN8 và OP2
Thông qua nghiên cứu đặc điếm sinh học và trình tự gen vùng ITS cho thấy, chủng nấm B68 và BBN8 được phân loại và định danh lần lượt là: Phanerochaete sp. B68 và Trametes hirsuta BBN8. (Hình 4)
Chất lượng bật sau nấu và khả năng loại bỏ nhựa của B68, BBN8 và OP2 quy mô 15 kg/mẻ
Nấu thu hồi bột giấy bằng phương pháp hóa học và kiếm tra hàm lượng nhựa cây trên dăm mảnh sau xử lý nấm 21 ngày. Kết quả trình bày trong Bảng 3.
Ba chủng nấm OP2, B68 và BBN8 đều không làm ảnh hưởng đến cellulose thu hồi sau nấu (thể hiện thông qua hiệu suất nấu), thông qua kiếm tra lượng kiềm dư cho thấy, các chủng nấm này cũng làm giảm lượng kiềm sử dụng trong quá trình nấu. Chỉ số Kappa phân tích cho thấy sử dụng các chủng nấm cho tiền xử lý trên mảnh, giúp giảm hàm lượng lignin trong bột sau nấu hơn so với đối chứng, và các mẫu bột nấu đều không còn tỷ lệ bột sống (Bảng 3).
Dựa trên khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển được trên mảnh không khử trùng, hiệu suất loại nhựa cao (>50%) và chất lượng bột giấy thu hồi sau nấu, các chủng nấm B68, BBN8 và OP2 được lựa chọn đế nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học phân hủy nhựa cây trong dăm mảnh gỗ keo.
4. KẾT LUẬN
Từ các kết quả trên có thế đi đến một số kết luận sau:
Từ bộ suti tập nấm và các mẫu nấm thu thập tại Nhà máy Giấy Bãi Bằng và Mục Sơn đã tuyến chọn được 85 chủng nấm có khả năng phân hủy nhựa cây từ Nhà máy giấy Bãi Bằng và Nhà máy Giấy Mục sơn. Các chủng này hầu hết đều sinh tổng hợp một trong 2 enzym phân hủy nhựa khảo sát là laccase và sterol esterase. Từ đó 32 chủng nấm (15 chủng nấm mục trắng, 2 chủng nấm dát gỗ và 15 chủng nấm mốc) được lựa chọn và kiếm tra sinh trưởng trên dăm mảnh gỗ keo.
32 chủng nấm thử nghiệm đều có khả năng phát triển trên dăm mảnh xông hơi, tuy nhiên chỉ có 3 chủng B68, BBN8 và OP2 là có khả năng phát triển trên dăm mảnh tươi không xông hơi. Ba chủng nấm OP2, B68 và BBN8 đều không làm ảnh hưởng đến cellulose thu hồi sau nấu, làm giảm lượng kiềm sử dụng trong quá trình nấu và giúp giảm hàm lượng lignin còn lại trong bột sau nấu hơn so với đối chứng.
Lụa chọn được 3 chủng nấm là Phanerochaete sp. B68; Trametes hirsuta BBN8 và Ophitnma piliferum OP2 đế sản xuất chế phẩm sinh học phân hủy nhựa cây trong dăm mảnh gỗ keo làm nguyên liệu sản xuất bột giấy thân thiện môi trường tại Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Brazkova M., MercatiA., Hristova L, LanteA., KrastanovA. (2016). Isolation, Purification and Characterization of Laccase from the White-rot Fungus Trametes versicolor. Scientific works of university of food technologies, 63(1): 155162.
2. Rueda C.O., Francisco J. Plou F.J., Ballesteros A., Martinez A.T., Martinez M.J. (2002) Production, isolation and characterization of a sterol esterase from Ophiostoma piceae. Biochim. Biophys. Acta., 1599:28-35.

PHAN THỊ HỒNG THẢO, NGUYỄN THỊ HỒNG LIÊN, TRẦN THỊ HƯƠNG
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
(Bài đăng trên Tạp chí Khoa học và Công nghệ Công Thương số 38 năm 2019)
Tổng số lượt truy cập :
  • 2
  • 6
  • 8
  • 6
  • 0
  • 8
  • 9
lên đầu trang