TÓM TẮT:
Nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá hoạt tính của prodigiosin (PG) là sản phẩm sau khi tách tinh sạch từ dịch nuôi cấy vi khuẩn trên dòng tế bào ung thư phổi H460 và ung thư thanh quản Hep2 in vitro. Sau khi được nuôi cấy tăng sinh đạt mật độ khoảng 80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy, hai dòng tế nào này được cấy chuyển sang đĩa 96 giếng có môi trường nuôi cấy chứa PG ở những nồng độ khác nhau (0,5µg/ml; 1µg/ml; 2µg/ml; 4 µg/ml; 6 µg/ml; 8 µg/ml và 10 µg/ml). Sau 24, 48 giờ tiếp xúc với PG, dung dịch MTT 5 mg/ml lần lượt được thêm vào các giếng nuôi cấy tế bào, tiến hành đo mật độ quang (OD) của phản ứng MTT ở bước sóng 595 nm. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của PG được đánh giá thông qua hình dạng tế bào, kết quả đo OD số lượng tinh thể formazan tạo thành của phản ứng MTT và tính IC50. Kết quả PG làm thay đổi hình dạng và ức chế mạnh gây chết cả hai dòng tế bào ung thư Hep2 và H460 in vitro. Tế bào H460 bị chết ở ở nồng độ 4-10 µg/ml với giá trị IC50 tương ứng ở 24 giờ và 48 giờ là 5,8 và 2,9; tế bào Hep2 bị chết ở nồng độ 6-10 µg/ml với IC50 24 giờ là 6,8 và IC50 48 giờ là 4,6. Nghiên cứu này đóng góp thêm vào kết quả hoạt tính chống ung thư của prodigiosin.
Từ khóa: Prodigiosin, Hep2, H460, Tế bào ung thư
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là vấn đề ngày càng được quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Theo số liệu báo cáo về ung thư, năm 2012 thế giới có khoảng 14,1 triệu trường hợp mới và khoảng 8,2 triệu ca tử vong do ung thư, dự đoán đến năm 2030 con số đó lên tới 13 triệu người. Trong các bệnh ung thư, ung thư phổi trở thành căn bệnh phổ biến nhất với 1,8 triệu bệnh nhân, chiếm 13% các loại bệnh ung thư. Tiếp đó đến ung thư vú với 1,7 triệu bệnh nhân và ung thư ruột kết, ung thư thanh quản..[1].
Hiện nay có nhiều nghiên cứu phát hiện nhằm tìm ra các các loại thuốc mới với mong muốn đạt được hiệu quả điều trị bệnh ung thư cao hơn. Trong những năm gần đây PG được biết đến và nhận được nhiều sự quan tâm bởi PG có các hoạt tính sinh học quý như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tế bào ung thư… PG là hợp chất có sắc tố màu đỏ là một chất chuyển hóa alkaloid thứ cấp có công thức hóa học là C20H25N3O, có khối lượng khoảng 323.4 Da [2]. PG thường được tổng hợp bởi vi khuẩn Serratia sp, Pseudomonas sp, Streptomyces sp và vi khuẩn Vibrio sp [3]. PG hiện nay còn được phát hiện nhiều tác dụng mới như ức chế miễn dịch, kháng ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư kháng thuốc. PG có khả năng gây ra apoptosis ở các dòng tế bào ung thư tạo máu (Jurkat, NSO, HL - 60 và Ramos) nhưng không ảnh hưởng tới các tế bào lành (Montaner et al., 2000) [4]. Chính vì vậy trong nghiên cứu này sau khi thu nhận được sản phẩm PG tách tinh sạch từ dịch nuôi cấy vi khuẩn, PG được đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung trên dòng tế bào Hep2 và H460 nhằm định hướng tạo sản phẩm có hoạt tính kháng tế bào ung thư.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu Prodigiosin từ dịch nuôi cấy vi khuẩn đã được tách tinh sạch, đinh lượng nồng độ được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu để đánh giá hoạt tính (được cung cấp từ đề tài mã số 07.17/CNSHCB). Các mẫu Prodigiosin được bảo quản ở -20oC cho đến khi tiến hành thí nghiệm
Dòng tế bào ung thư phổi H460 và ung thư thanh quản Hep2 (ATCC, Mỹ) được sử dụng làm mô hình đánh giá hoạt tính PG ức chế tế bào một số dòng tế bào ung thư in vitro.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nuôi cấy tăng sinh tế bào:
Để sử dụng dòng tế bào ung thư thanh quản Hep2 và ung thư phổi H460 làm mô hình để thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư của prodigiosin. Dòng tế bào Hep2 và H460 được giải đông hoặc cấy chuyển được nuôi cấy trong môi trường RPMI (RPMI bổ sung 10% FBS, 1% Penicillin và Streptomycin - Gibco, Mỹ), nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C, 5% CO2. Tế bào được nuôi cấy đến khi đạt được mật độ khoảng 80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển và chia tế bào ra làm nhiều đĩa nuôi cấy mới để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo.
Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư của prodigiosin:
Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư của prodigiosin dựa trên Kỹ thuật MTT (dựa theo Mosmann T .,1983 [6]; Đỗ Minh Trung và CS.,2015 [7]): Tế bào Hep2 và H460 được cấy chuyển và nuôi cấy trong đĩa 96 giếng (Corning, Mỹ). Tế bào được tiếp xúc với prodigiosin được chuẩn bị ở những nồng độ khác nhau (0,5 µg/ml; 1 µg/ml; 2 µg/ml; 4 µg/ml; 6 µg/ml; 8 µg/ml và 10 µg/ml) và nhóm đối chứng (RPMI) là tế bào được nuôi cấy bình thường không tiếp xúc với prodigiosin. Sau 24, 48 giờ tiếp xúc với PG bổ sung dung dịch MTT 5 mg/ml (Sigma, Mỹ) lần lượt được thêm vào các giếng nuôi cấy tế bào. Các tế bào sống hoạt động sinh ra các dehydrogenase gây ra phản ứng khử MTT tạo ra các tinh thể formazan có màu tím. Lượng tinh thể formazan được tạo ra trong trong thử nghiệm nhiều hay ít sẽ phản ánh hoạt tính ức chế tế bào của PG mạnh hay yếu. Số lượng tinh thể formazan tạo thành được đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 595nm (Hệ thống DTX 880 - Backman Coulter, Mỹ).
Kết quả đánh giá hoạt tính PG ảnh hưởng đến tế bào nuôi cấy bằng sự nguyên vẹn về hình thái tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi soi ngược (Olympus IX83-Olympus, Nhật Bản) và sự tăng sinh của tế bào bằng kết quả đo OD lượng tinh thể formazan của phản ứng MTT. Các thí nghiệm được lặp lại 6 lần (n=6).
Tính liều ức chế 50% tế bào (IC50):
Căn cứ kết quả thử nghiệm MTT, tính tỷ lệ phần trăm tế bào sống trong các giếng có bổ sung PG tiếp xúc với tế bào so với nhóm chứng không bổ sung PG. Dựa trên tỷ lệ tế bào sống trong các nhóm nghiên cứu và nồng độ PG sử dụng, lập phương trình hồi quy tuyến tính tính giữa tỷ lệ tế bào sống (Y, %) và nồng độ PG (X, mg/ml).
Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng: Y = ax + b. Từ phương trình hồi quy tuyến tính, tính liều ức chế 50% tế bào (IC50) của PG ở thời điểm 24 giờ và 48 giờ trên các dòng tế bào ung thư theo công thức:
(a, b lấy từ phương trình hồi quy tuyến tính Y = ax + b)
Thời điểm đánh giá: sau 24, 48 giờ cho tế bào tiếp xúc với các mẫu nghiên cứu trong môi trường nuôi cấy.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào H460 của PG
Tế bào H460 được tiếp xúc với PG với các nồng độ từ 0.5-10 µg/ml và RPMI (đối chứng). Sau 24 và 48 giờ tiếp xúc với PG kết quả được thể hiện ở hình 1, hình 2, bảng 1 và biểu đồ 1.
Hình 1. Tế bào H460 sau 24 giờ (hình 1A) và 48 giờ (hình 1B) tiếp xúc với PG
(0,5-10 µg/ml: PG ở các nồng độ từ 0,5-10 µg/ml, RPMI: Tế bào Hep460 nuôi cấy bình thường - đối chứng), 200X.
Hình 2. Một số hình ảnh tế bào H460 tạo tinh thể formazan sau khi bổ sung MTT.
(hình 2A: 24 giờ và hình 2B: 48 giờ tiếp xúc với PG; 0,5-10 µg/ml: PG nồng độ từ 0,5-10 µg/ml, RPMI: Tế bào H460 nuôi cấy bình thường - đối chứng), 200X.
Bảng 1. Kết quả đo OD phản ứng MTT sau khi tiếp xúc PG với tế bào H460
Biểu đồ 1. Kết quả đo OD phản ứng MTT và Phương trình hồi quy tuyến tính
tính IC50 sau 24 và 48 giờ tiếp xúc PG với tế bào H460.
Kết quả ở hình 1, hình 2, bảng 1 và biểu đồ 1 cho thấy ở nhóm đối chứng tế bào H460 không cho tiếp xúc với prodigiosin, tế bào H460 phát triển bình thường không thấy tế bào chết, khi đo phản ứng MTT hệ số OD cũng cao hơn so với mẫu có tiếp xúc. Đối với các mẫu được tiếp xúc với PG, thời điểm sau 24 giờ PG ức chế tế bào khá tốt ở các nồng độ 6,8,10 µg/ml, làm cho hầu hết các tế bào H460 bị chết và số lượng tinh thể formazan tạo ra do chuyển hóa từ MTT không nhiều. Còn các nồng độ PG thấp hơn từ 0.5-4 µg/ml PG chưa thấy rõ biểu hiện của PG ảnh hưởng lên dòng tế bào này, nhưng có sự thay đổi về hình dạng tế bào. Ở thời điểm sau 48 giờ tiếp xúc PG thì thời điểm này PG có khả năng ức chế tế bào tốt hơn thời điểm 24 giờ ở các nồng độ cao 6-10 µg/ml PG tế bào đã co tròn và chết gần như hoàn toàn.
Kết quả tính IC 50: Căn cứ kết quả thử nghiệm MTT, tính tỷ lệ phần trăm tế bào sống trong các giếng tiếp xúc với PG so với nhóm chứng không bổ sung PG để tích IC 50. IC50 của PG trên tế bào H460 ở thời điểm 24 giờ là 5.8 và sau 48 giờ là 2,9.
3.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào Hep2 của PG
Tương tự như thử khả năng ức chế tế bào H460, Tế bào Hep2 sau 24, 48 giờ tiếp xúc với PG với các nồng độ từ 0,5 - 10 µg/ml và RPMI (đối chứng). Kết quả được thể hiện ở hình 3, hình 4, bảng 2 và biểu đồ 2.
Hình 3. Tế bào Hep2 sau 24 giờ (hình 3A) và 48 giờ (hình 3B) tiếp xúc với PG.
(0,5-10 µg/ml: PG ở các nồng độ từ 0,5-10 µg/ml, RPMI: Tế bào Hep2 nuôi cấy bình thường - đối chứng), 200X.
Hình 4. Một số hình ảnh tế bào Hep2 tạo tinh thể formazan sau khi bổ sung MTT.
(hình 2A: 24 giờ và hình 2B: 48 giờ tiếp xúc với PG; 0,5-10 µg/ml: PG nồng độ từ 0,5-10 µg/ml, RPMI: Tế bào H460 nuôi cấy bình thường - đối chứng), 200X.
Bảng 2. Kết quả đo OD phản ứng MTT sau khi tiếp xúc PG với tế bào Hep2
Biểu đồ 2. Kết quả đo OD phản ứng MTT và Phương trình hồi quy tuyến tính
tính IC50 sau 24 và 48 giờ tiếp xúc PG với tế bào Hep2.
Kết quả ở hình 3, hình 4, bảng 2 và biểu đồ 2 cho thấy: đối với nhóm bổ sung PG, ở nồng độ PG cao từ 8-10 µg/ml tế bào Hep2 có sự thay đổi về hình dạng tế bào và nhiều tế bào bị chết, do đó lượng tinh thể formazan tạo ra khá ít (hệ số đo OD thấp). Các nồng độ PG thấp hơn như 4-6 µg/ml cũng có sự thay đổi về hình thái tế bào và có tác dụng gây ức chế khả năng tăng sinh của tế bào Hep2, nhưng số lượng formazan được tạo ra đã tăng lên nhiều hơn so với ở nồng độ 8-10 µg/ml. Ở các nồng độ thấp như 0,5-2 µg/ml PG ức chế ít đối với tế bào chính vì thế mà lượng tinh thể formazan tạo thành nhiều do đó hệ số đo OD cao hơn.
Kết quả tính IC 50: Căn cứ kết quả thử nghiệm MTT, tính tỷ lệ phần trăm tế bào sống trong các giếng tiếp xúc với PG so với nhóm chứng không bổ sung PG. IC50 của PG ở thời điểm 24 giờ trên dòng tế bào Hep2 xác định được là 6.8 và sau 48 giờ là 4,6.
IV. BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này sau khi cho PG tiếp xúc với tế bào ở các nồng độ khác nhau để đánh giá hoạt tính. Đối với dòng tế bào H460 tiếp xúc với PG ở nồng độ cao sau 24 giờ có nhiều tế bào trong giếng nuôi cấy bị chết và tách ra khỏi bề mặt giếng nuôi cấy (hình 1A-10 µg/ml, hình 2A-10 µg/ml) và sau 48 giờ hầu hết tế bào bị chết, các tế bào sống còn lại thì hầu hết không còn chức năng để chuyển hóa MTT thành tinh thể formazan và kết quả đo OD phản ứng MTT là rất thấp 0,0497 ± 0,0027. Ở các thử nghiệm khi cho tiếp xúc PG ở các nồng độ thấp hơn, mức độ hưởng của PG trên tế bào cũng khác nhau từ số lượng tế bào chết nhiều cho đến chết ít hoặc ảnh ảnh hưởng rất ít, nhưng hầu hết trong nghiên cứu tế bào H460 đều có sự thay đổi về hình dạng tế bào ở cả hai thời điểm sau 24 và 48 giờ so với mẫu đối chứng không có tiếp xúc prodigiosin (hình 1, hình 2 – RPMI, biểu đồ 1 và bảng 1).
Tương tự như đánh giá hoạt tính PG trên tế bào H460. Đối với thử nghiệm trên tế bào Hep 2, ở nồng độ PG cao đều thấy nhiều tế bào trong giếng nuôi cấy bị chết và tách ra khỏi bề mặt giếng nuôi cấy, Ở nồng độ 6µg/ml và 8µg/ml kết quả thấy số lượng tế bào chết ít hơn nhưng tất cả tế bào có hiện tượng bị co lại và thay đổi hình dạng (hình 3 6-8µg/ml). Ở nồng độ 2µg/ml và 4µg/ml prodigiosin sau khi tiếp xúc với tế bào và với nồng độ thấp hơn là 0.5µg/ml và 1µg/ml prodigiosin tế bào Hep2 hầu như không ảnh hưởng gì ở thời điểm 24 giờ nhưng đến 48 giờ tế bào Hep2 bị PG ức chế mạnh hơn và có sự thay đổi về hình dạng tế bào so với nhóm đối chứng là tế bào Hep2 không cho tiếp xúc với prodigiosin.
Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của PG và kết quả đều thấy được PG có hoạt tính ức chế tế bào ung thư [5]. Beatriz Montaner và CS.,2000 công bố nghiên cứu về đánh giá ảnh hưởng dịch nuôi cấy từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens 2170 (CS-2170) có chứa prodigiosin đến khả năng sống sót và khả năng gây apoptosis trên các dòng tế bào ung thư máu khác nhau (Jurkat, NSO, HL-60 và Ramos) và tế bào bình thường (NIH-3T3 và MDCK) [4]. Sau khi thử nghiệm số lượng tế bào giảm nhanh sau 4 giờ bằng xét nghiệm MTT. Tác dụng gây độc tế bào này là do quá trình apoptosis. Kết quả nghiên cứu này cho thấy prodigiosin có khả năng gây ra apoptosis trong các tế bào ung thư máu nhưng không có độc tính khi thử nghiệm trên tế bào bình thường.
Năm 2017, Yenkejeh và CS đã nghiên cứu thử nghiệm đánh giá PG trên dòng tế bào HepG2, kết quả cho thấy PG đã làm thay đổi hình thái của các tế bào thành dạng apoptotic và làm gián đoạn các kết nối tế bào. Hợp chất này làm tăng đáng kể tỷ lệ ức chế tăng trưởng và giảm hoạt động trao đổi chất của tế bào HepG2 một cách tuyến tính giữa nồng độ và thời gian tiếp xúc. Sau 24 và 48 giờ tiếp xúc với PG ở nồng độ dao động từ 100 nM đến 600 nM, tỷ lệ ức chế tăng trưởng lần lượt là 1,5-10%, 24-47,5% và 55,5-72,5%, so với các mẫu không được tiếp xúc PG. Trong điều kiện tương tự, các hoạt động trao đổi chất được đo là 91-83%, 74-53% và 47-31% khi so sánh giữa các mẫu không được tiếp xúc và được tiếp xúc [8] .
Để thử hoạt tính prodigiosin cũng có nhiều phương pháp và có thể sử dụng nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau để thử nghiệm. Một số nghiên cứu không chỉ đánh giá hoạt tính của prodigiosin kháng tế bào ung thư mà đánh giá trên các dòng tế bào bình thường khác. Trong nghiên cứu này đã sử dụng dòng tế bào Hep2 và H460 có sẵn và đánh giá hoạt tính trước và sau khi tiếp xúc tế bào ung thư với PG có so sánh với nhóm đối chứng là không bổ sung PG và cũng đánh giá bằng xét nghiệm MTT. Kết quả cũng cho thấy PG tách chiết, tinh sạch được từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn có hoạt tính ức chế tế bào ung thư phổi H460 và tế bào ung thư thanh quản Hep2. Ở hầu hết các nồng độ được thử nghiệm đều thấy có sự thay đổi về hình thái tế bào cũng như đã có tác dụng gây ức chế khả năng tăng sinh của tế bào. Kết quả trên tại các thời điểm đánh giá cũng khá phù hợp với các tác giả đã công bố trước đó.
V. KẾT LUẬN
Prodigiosin có hoạt tính ức chế tế bào Hep 2 và H460 in vitro: PG làm thay đổi hình dạng và ức chế mạnh gây chết tế bào Hep2 ở nồng độ 6-10 µg/ml. IC50 24 giờ: 6,8, IC50 48 giờ: 4,6.PG làm thay đổi hình dạng và ức chế mạnh gây chết tế bào H460 ở nồng độ 4-10 µg/ml. IC50 24 giờ: 5,8, IC50 48 giờ: 2,9. Kết quả nghiên cứu này đóng góp thêm vào kết quả về hoạt tính chống ung thư của prodigiosin.
Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi đề tài mã số 07.17/CNSHCB do Học viện Quân y chủ trì. Nhóm tác giả xin trân trọng cảm ơn Học viện Quân y, Viện Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu hệ Gen – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã ủng hộ, tạo điều kiện và tích cực hợp tác trong quá trình nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bernard W. Stewart and Christopher P. Wild (2014). World Cancer Report 2014. The International Agency for Research on Cancer.
2. Zara Shaikh (2016). Biosynthesis of Prodigiosin and Its Applications. IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences. Volume 11, Issue 6 Ver V:01-28.
3. Maheswarappa G, Kavitha D, Vijayarani K and Kumanan K (2013). Prodigiosin as anticancer drug Produced from bacteria of termite gut. Indian Journal of Basic and Applied Medical Research. 3(1):257-266.
4. Beatriz Montaner, Sira Navarro, Maria Piqué and et.al (2000). Prodigiosin from the supernatant of Serratia marcescens induces apoptosis in haematopoietic cancer cell lines. Br J Pharmacol. 131(3): 585–593.
5. Darshan N and Manonmani H. K (2015). Prodigiosin and its potential applications. J Food Sci Technol. 52(9): 5393–5407.
6. Mosmann T (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods. 65(1-2): 55-63.
7. Đỗ Minh Trung, Nguyễn Minh Phương, Phạm Thế Tài, Lê Văn Đông (2015). Đánh giá hoạt tính độc tố tả tách chiết từ môi trường nuôi cấy trên dòng tế bào Hepa-1c1c7 và H4-II-E-C3. Tạp chí Sinh lý học Việt Nam. Số 19(2). Tr:18-25.
8. Yenkejeh RA, Sam MR and Esmaeillou M (2017). Targeting survivin with prodigiosin isolated from cell wall of Serratia marcescens induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells. Human and Experimental Toxicology. Vol. 36(4): 402–411.
Đỗ Minh Trung1, Đỗ Thị Tuyên2, Nguyễn Thùy Dương3,
Nguyễn Lĩnh Toàn1, Trần Viết Tiến1, Nguyễn Duy Bắc1, Lê Thị Hồng Hạnh1
1Học viện Quân y; 2Viện Công nhệ Sinh học-Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam; 3Viện Nghiên cứu hệ Gen-Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
Đăng nhập
