Trong nghiên cứu này chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris X33.SI36.15 đã được sử dụng để nghiên cứu quá trình lên men và chuyển hóa đồng thời đường sucrose thành đường chức năng isomaltulose. Hiệu suất chuyển hóa đạt được 90-95% tại nồng độ đường 40% chỉ sau 16 giờ. Nghiên cứu cũng chỉ ra nhiệt độ tối ưu cho quá trình chuyển hóa là từ 28÷30°C và pH 5.5- 7. Quá trình sản xuất thử nghiệm quy mô pilot 100kg/mẻ được nghiên cứu đề xuất và xây dựng dựa trên kết quả thí nghiệm. Công nghệ chuyển hóa tạo isomaltulose có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế biến đường chức năng tạo giá trị gia tăng cho sản xuất công nghiệp chế biến. 

Từ khóa: isomaltulose, lên men và chuyển hóa đồng thời, Pichia pastoris, sucrose isomerase.

Đường chức năng Isomaltulose thu được từ sucrose nhờ enzyme chuyển hóa liên kết glucosyl- fructoside từ (1-2) fructoside thành (1-6) fructoside, là một đường phân giải chậm, khiến cho chỉ số đường huyết trong máu duy trì ở mức độ thấp hơn so với đường sucrose. Do đó, dẫn đến cung cấp năng lượng cân bằng và kéo dài hơn glucose. Trong tự nhiên, Isomaltulose có trong mật ong tự nhiên và chiết xuất mía đường, có vị tương tự như sucrose với độ ngọt khoảng 50% so với sucrose. 

Đi đầu trong sản xuất sản phẩm từ isomaltulose là tập đoàn Südzucker của Đức cũng là nhà sản xuất đường lớn nhất của châu Âu, thương hiệu Palatinit®, với 2 sản phẩm là Palatinose™ và galenIQ™. Công nghệ sản xuất isomaltulose phổ biến nhất hiện nay mà các công ty trên thế giới đang sử dụng là cố định tế bào chủng Protaminobacter rubrum (=Serratia plymuthica) CBS 574.44 [9,12]. Nhiều gene mã hóa sucroseisomerase đã được tách dòng và biểu hiện, phổ biến nhất là từ chủng Klebsiella sp. hay từ Enterobacter sp; tuy nhiên chỉ ở trong quy mô nghiên cứu phòng thí nghiệm [12,13].  

Tại Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tiến hành nghiên cứu các chủng có khả năng sinh tổng hợp isomaltulose thuộc các loài Klebsiella variicola, Enterobacter cloacae, Klebsiella sp., Enterobacter sp. Nghiên cứu sử dụng sinh khối tế bào chuyển hóa đạt xấp xỉ 80% hiệu suất với dung dịch sucrose 25% [2]. Nhóm cũng đã tách dòng và biểu hiện thành công gen mã hóa sucrose isomerase trong nấm men tạo enzyme tái tổ hợp [5] và thành công tạo chủng nấm men tái tổ hợp có khả năng lên men và chuyển hóa đồng thời với bằng độc quyền giải pháp hữu ích [1]. Nghiên cứu này khảo sát một số điều kiện chuyển hóa sucrose thành isomaltulose sử dụng chủng tái tổ hợp Pichia pastoris X33.SI36.15.

Chủng tái tổ hợp Pichia pastoris X33.SI36.15 (Pichia pastoris CNTP 9102) được sử dụng cho cả quá trình nghiên cứu. Chủng được tạo thành từ đoạn gen mã hóa sucrose isomerase có độ dài 1713bp tách dòng từ chủng vi khuẩn Klebsiella sp. ISB8 trong bộ sưu tập giống tại Viện CNTP. Vector biểu hiện được lựa chọn là vector pGAPZαA cho ưu điểm là không sử dụng cảm ứng methanol [1]. Đường sucrose có độ tinh khiết 99% được cung cấp thương mại từ nhà máy đường Lam Sơn.

Thành phần sucrose, isomaltulose, glucose được phân tích sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hãng Shimadzu Corporation, Nhật Bản, cột COSMOSIL 5C18MSII (4.6mmI.Dx250mm, Nacalai, Hoa Kỳ) với detector RID. Dung môi nước với tốc độ dòng 0.5 mL/ phút ở nhiệt độ 40°C. Các đường chuẩn sử dụng gồm isomaltulose (Wako, Nhật Bản), Sucrose (Merk, Đức), và D-Glucose (Merk, Đức).

Một thể tích 200 µL dịch đường đã pha loãng được mix với 400µL thuốc thử DNS sau đó phản ứng ở 95°C trong 5 phút và được đo độ hấp thụ màu ở bước sóng 540nm. Đường chuẩn được xây dựng sử dụng là isomaltulose (Wako, Nhật Bản) [5,10].

Nhân giống: Chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris X33.SI36.15 được nuôi trên thạch đĩa YPD ở 28°C. 

Sau 48h, cấy 2 vòng que cấy vào 20 ml dung dịch YPD chứa trong bình tam giác 100ml, nuôi lắc 150 vòng/phút ở 28°C trong 16h. Lên men chuyển hóa đồng thời: Tiếp giống từ môi trường YPD sang môi trường chuyển hóa 2YP (sucrose 40%, peptone 1%, cao nấm men 0.5%, pH 5) theo tỷ lệ thể tích 1:9. Lượng tế bào sẽ chuyển hóa dung dịch sucrose trong 24h ở 28°, lắc 150 vòng/ phút với bình tam giác và sục khí 0,2v/v/m, khuấy 250 vòng/ phút đối với thiết bị lên men. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, hoặc lọc khung bản đối với lên men pilot để loại bỏ các tế bào. Thu dịch mẫu dùng để phân tích. Hiệu suất chuyển hóa được tính toán dựa trên tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ sản phẩm đường isomaltulose tạo thành so với nồng độ cơ chất sucrose ban đầu.

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa sucrose thành isomaltulose được nghiên cứu bao gồm nồng độ cơ chất ban đầu: 20%, 30%, 40%, 50%, 60%; nhiệt độ chuyển hóa: 20°C, 24°C, 28°C, 32°C, 36°C; pH ban đầu: 4, 5, 6, 7, 8 được tiến hành trên quy mô bình tam giác 1L với thể tích lên men 200mL trong 24h chuyển hóa. Trong thí nghiệm thời gian chuyển hóa, các điều kiện tối ưu cho quá trình chuyển hóa thu được từ các thí nghiệm trên được áp dụng trên thiết bị lên men 2L của hãng Solaris, Italia và theo dõi từ 0 tới 24h. Điều kiện chuyển hóa: nồng độ cơ chất 40%, pH6 nhiệt độ 28°C, khuấy trộn 250 vòng/ phút. Sản phẩm cuối được phân tích nồng độ đường isomaltulose và sucrose bằng phương pháp HPLC và DNS. 

Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, thời gian chuyển hóa được khảo sát. Nghiên cứu điều kiện chuyển hóa và nồng độ cơ chất được tiến hành phản ứng trong 24h để đảm bảo các phản ứng đạt hiệu suất tối đa. 

Đối với nồng độ cơ chất sucrose, việc sử dụng nồng độ cơ chất cao sẽ giúp giảm chi phí cho các công đoạn cô đặc và kết tinh sau này, vì vậy các nồng độ cơ chất từ 20% đến 60% được khảo sát với mật độ tế bào 10% để đánh giá hiệu suất chuyển hóa. 

Kết quả cho thấy hiệu suất cao nhất 87.0% đạt được ở nồng độ 40%. Ở nồng độ 20%, hiệu suất chuyển hóa là thấp nhất và chỉ đạt 63.2%. Với nồng độ cao 60%, hiệu suất chuyển hóa giảm xuống 75.3% (Hình 2.A).

Đối với nhiệt độ, khoảng nhiệt độ tối ưu cho nấm men được khảo sát là 20°C, 24°C, 28°C, 32°C, và 36°C. Kết quả cho thấy hiệu suất chuyển hóa đường sucrose thành isomaltulose cao nhất là 87.2% ở nhiệt độ 28°C.  Khi nhiệt độ cao hơn hiệu suất chuyển hóa giảm dần: 85% tại 32°C và 72.5% tại 36°C. 

Tại nhiệt độ 20°C và 24°C hiệu suất chuyển hóa đường isomaltulose chỉ đạt 53.2% và 63%. Điều này cho thấy chủng nghiên cứu khá nhạy cảm với nhiệt độ chuyển hóa. Tương tự nhiệt độ, dải pH từ 4-10 được khảo sát cho thấy tại pH4.0 hiệu suất chuyển hóa tốt nhất đạt 79%, thấp hơn tại pH 5-7 (84-86%) và giảm mạnh ở pH9 (32.2%) và pH 10 (12%). Như vậy, quá trình chuyển hóa tối ưu trong khoảng pH 5-7 (Hình 2B,2C).

Thí nghiệm khảo sát thời gian được tiến hành trong 24h với tỉ lệ sinh khối là 10% tại pH6 nhiệt độ 28°C trên thiết bị lên men 2L với tốc độ khuấy 250 vòng/phút. Kết quả cho thấy phản ứng diễn ra nhanh, đạt hiệu suất tới 90% trong vòng 12 giờ đầu và đạt ngưỡng tối đa trong khoảng từ 16-20h (94%). Có thể giả thiết điều kiện khuấy trộn sục khí đã làm tăng hiệu suất chuyển hóa. Như vậy, thời gian tối ưu để đạt được hiệu suất chuyển hóa cao là từ 16-20h (Hình 2D).

Qua khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình chuyển hóa sucrose thành isomaltulose có thể kết luận các thông số tối ưu cho quá trình chuyển hóa bao gồm: nồng độ sucrose 40%, nhiệt độ 28°C, pH 5-7, thời gian 16-20h.

Sơ đồ công nghệ sản xuất isomaltulose quy mô 100kg/mẻ sử dụng chủng tái tổ hợp Pichia pastoris X33.SI36.15 thể hiện ở sơ đồ Hình 3 và Bảng 1 là kết quả của nhóm nghiên cứu thuộc đề tài ĐT.04.2016/CNSHCB nhằm mục đích ứng dụng vào thực tế sản xuất trong công nghiệp.

Quá trình sản xuất sử dụng môi trường YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) để nhân giống, môi trường 2YP (sucrose 4%, peptone 1%, cao nấm men 0.5%, pH 5.5) để tạo sinh khối, nồng độ sucrose 40%, pH 5. Sinh khối tế bào 40L giống được cấp cho 220L nước đã bổ sung môi trường (3kg pepton, 1,5kg yeast extract, thanh trùng 120°C/15 phút và bổ sung 120kg đường khi nhiệt độ hạ xuống 80°C). Quá trình lên men và chuyển hóa đường sucrose thành isomaltulose đồng thời diễn ra ở 28°C khuấy 250 vòng/phút trong 24 giờ. 

Dịch sau khi chuyển hóa được lọc khung bản để loại sinh khối nấm men và thu hồi dịch đã chuyển hóa. Dịch sau khi thu hồi được xử lý màu, loại muối bằng cột trao đổi ion. Dịch sau đó được cô đặc tới 700 Bx bằng thiết bị cô đặc màng áp suất chân không với dung tích 100L/mẻ và công suất bay hơi 60kg/h. Quá trình kết tinh diễn ra sau đó ở nhiệt độ phòng (25-30°C) trong thời gian từ 24-48h. 

Đường kết tinh được thu hồi bằng ly tâm vắt và rửa 1-2 lần bằng nước RO (nếu cần) trên cùng thiết bị ly tâm. Để thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao có thể tiến hành hòa tan trong nước RO và kết tinh lần 2. Trong quá trình sản xuất thử nghiệm nhiều công đoạn đã sử dụng đường sản phẩm cho các nghiên cứu khác nhau và hiệu suất thu hồi theo tính toán của quy mô phòng thí nghiệm có thể đạt được trên 80%.

Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được quy trình sản xuất và thu hồi sản phẩm đường isomaltulose dựa trên kết quả thực hiện ở quy mô pilot có tính áp dụng thực tiễn và sẵn sàng chuyển giao công nghệ. Hiệu suất chuyển hóa đường isomaltulose từ chủng tái tổ hợp Pichia pastoris X33.SI36.15 (Pichia pastoris CNTP 9102) có thể đạt được hiệu suất hơn 90% trong điều kiện 40% cơ chất ở nhiệt độ là 28°C, pH 5-7, thời gian là 16-20h. Chủng chủng tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp trong quá trình lên men mà không sử dụng chất cảm ứng methanol là một bước tiến lớn trong quá trình tạo chủng tái tổ hợp có tiềm năng ứng dụng không chỉ trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm mà còn trong lĩnh vực y dược trong tương lai

1. Bằng độc quyền giải pháp hữu ích số 2455 – “Chủng nấm men Pichia pastoris X33 tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp enzyme sucrose isomerase.” cấp ngày 22/9/2020.

2. Nguyễn Thanh Thủy, Nguyễn Thị Hoa Mai, Đinh Thị Mỹ Hằng, Vũ Nguyên Thành (2013) Công nghệ sản xuất isomaltulose từ sucrose sử dụng nấm men Enterobacter SP., Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 51 số (2).

1. Ahn SJ, Yoo JH, Lee HC, Kim SY, Noh BS, Kim JH, Lee JK (2003) Enhanced conversion of sucrose to isomaltulose by a mutant of Erwinia rhapontici, Biotechnol Lett, 25:1179–1183.

2. Bornke F, Haji Rezaei M, Sonnewald U (2001) Cloning and characterization of the gene cluster for palatinose metabolism from the phytopathogenic bacterium Erwinia rhapontici, J Bacteriol, 183:2425–2530. 

3. Brown SH, Sjoholm C, Kelly RM (1993) Purification and characterization of a highly thermostable glucose isomerase produced by the extremely thermophilic eubacterium, Thermotoga maritima. Biotechnol Bioeng 41:878–886. 

4. Brunner S, Holub I, Theis S, Gostner A, Melcher R, Wolf P, Amann-Gassner U, Scheppach W, Hauner H (2012) Metabolic effects of replacing sucrose by isomaltulose in subjects with type 2 diabetes: a randomized double-blind trial. Diabetes Care 35:1249–1251.

5. Cao Xuân Bách, Đặng Thị Kim Anh, Nguyễn Thanh Thủy, Trương Tú Anh, Nguyễn Thị Diệu Linh, Vũ Nguyên Thành. 2019. Cloning of sucrose isomerase encoding gene from Klebsiella singaporensis.ISB-36 and its expression in Pichia pastoris. (Tạp chí công nghệ sinh học, 17(4): 1-8, 2019).

6. Cha J, Jung JH, Park SE, Cho MH, Seo DH, Ha SJ, Yoon JW, Lee OH, Kim YC, Park CS (2009) Molecular cloning and functional characterization of a sucrose isomerase (isomaltulose synthase) gene from Enterobacter sp.FMB-1, J appl Microbiol, 107:1119–1130.

7. Cheetham PSJ (1987) Production of isomaltulose using immobilized microbial cells. Methods Enzymol 136:432–454.

8. Cheetham PSJ, Bucke C (1999) Production of isomaltulose using immobilized bacterial cells. Methods Biotechnol 10:255–260.

9. Goulter KC, HashimiSM, Birch RG (2012) Microbial sucrose isomerases: Producing organisms, genes and enzymes. Enzyme Microb Technol 50(1): 57–64.

10. Kim, Y., Koo, B. S., Lee, H. C., & Yoon, Y. (2015). Improved production of isomaltulose by a newly isolated mutant of Serratia sp. cells immobilized in calcium alginate. Canadian journal of microbiology, 61(3), 193-199.

11. Mu W, Li W, Wang X, Zhang T, Jiang B (2014b) Current studies on sucrose isomerase and biological isomaltulose production using sucrose isomerase. Appl Microbio Biotechnol 98(15): 6569–6582.

12. Park JY, Jung JH, Seo DH, Ha SJ, Yoon JW, Kim YC, Park CS (2010) Microbial production of palatinose through extracellular expression of a sucrose isomerase from Enterobacter sp. FMB-1 in Lactococcus lactis MG1363. Bioresour Technol 01(22): 8828–8833.

13. Zhang D, Li N, Lok SM, Zhang LH, Swaminathan K (2003) Isomaltulose synthase (PalI) of Klebsiella sp. LX3: Crystal structure and implication of mechanism. J Biolo Chem 278(37): 35428–35434.

(Nguồn: Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Số 48 - Tháng 7/2022)​