Thứ năm, 24/09/2020 | 21:48

Thứ năm, 24/09/2020 | 21:48

Bài báo khoa học

Cập nhật 08:00 ngày 04/09/2020

Sàng lọc và định danh các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh từ các mẫu sinh vật biển và trầm tích biển thuộc vùng biển đảo Lý Sơn - Quảng Ngãi

TÓM TẮT
Hiện nay, xạ khuẩn biển được đánh giá là nguồn tiềm năng trong việc tìm kiếm các chất kháng sinh cũng như các chất có hoạt tính sinh học. Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập và sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn từ môi trường biển. 61 chủng xạ khuẩn đã được phân lập từ 80 mẫu sinh vật biển và trầm tích biển được thu thập từ đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi. Các chủng được lên men trong môi trường A1, dịch lên men được chiết với ethyl acetate và làm bay hơi dung môi bằng cô quay chân không để tạo ra cặn chiết thô. Hoạt tính kháng sinh của các cặn chiết được thực hiện trên 7 chủng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ), gồm ba chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella enterica ATCC13076), ba chủng Gram dương (Enterococcus faecalis ATCC29212, Stapphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC 13245), và nấm men Candida albicans ATCC10231. Từ kết quả sàng lọc hoạt tính, đã chọn được 3 chủng xạ khuẩn (G330, G336 và G361) có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất, ức chế 5/7 chủng VSVKĐ với các giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ 4 đến 256 µg/ml tùy thuộc vào từng chủng kiểm định. Cụ thể, cả ba chủng này đều ức chế C. albicans ATCC10231 và ba chủng Gram dương. Ngoài ra, G330 và G336 còn thể hiện hoạt tính ức chế chủng Gram âm S. enterica ATCC13076 với giá trị MIC = 256 µg/ml và G361 có khả năng ức chế khá tốt đối với E. coli ATCC25922 với giá trị MIC là 8 µg/ml. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen 16S rRNA, kết quả cho thấy chủng G330 thuộc chi Streptomyces, các chủng G336 và G361 được xác định là thành viên của chi Salinispora, với độ tương đồng hơn 99% so với các trình tự gen 16S rRNA trên ngân hàng gen quốc tế. Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường biển có tiềm năng lớn để phân lập các chủng xạ khuẩn cho mục đích tìm kiếm các chất kháng khuẩn cũng như các hoạt chất sinh học khác.
Từ khoá: hoạt tính kháng vi sinh vật, MIC, trình tự 16S rRNA, xạ khuẩn
MỞ ĐẦU
Ngày nay, một trong những vấn đề quan trọng nhất liên quan đến sức khỏe của con người đó là sự gia tăng, xuất hiện và lây lan các vi sinh vật kháng kháng sinh (như vi khuẩn, nấm, virus và ký sinh trùng). Đặc biệt với vi khuẩn, tình trạng kháng kháng sinh đang gia tăng ở cả trong cộng đồng và trong bệnh viện cùng với đó là sự gia tăng tỷ lệ tử vong và bệnh tật (Powerset al., 2004).
Tháng 8 năm 2016, Tại Trung tâm sức khỏe Washoe quận Reno thuộc bang Nevada (Mỹ), từ một bệnh nhân bị nhiễm khuẩn cấp đã phát hiện loài Klebsiella pneumonia thuộc họ Enterobacteriaceae kháng lại kháng sinh carbapenem (CRE) và kháng tất cả các loại thuốc kháng khuẩn trên thị trường (Chen et al., 2017). Với sự gia tăng của các mầm bệnh đa kháng thuốc này, số lượng kháng sinh hiệu quả đã giảm đáng kể. Bệnh truyền nhiễm đang là mối đe dọa sức khỏe cộng đồng và được coi là một trong những thách thức lớn trong thế kỷ này (WHO, 2014). Trong số các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc vi sinh vật đã được công bố sử dụng trên thế giới thì 45% được sinh ra từ xạ khuẩn, 38% từ nấm và 17% từ vi khuẩn (Arnoldet al., 2009). 
Trong đó, chi Streptomyces được biết đến nhiều nhất về khả năng tổng hợp các chất kháng sinh. Các chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ xạ khuẩn đã được nghiên cứu bao gồm aminoglycoside, anthracyclin, lycopeptide, β- lactam, macrolides, nucleoside, peptide, polyene, polyeste, polyketide, actinomycin và tetracycline (Goodfellow et al., 1996).
Từ lâu vi sinh vật được biết đến như là nguồn cung cấp chính cho những khám phá về các chất có hoạt tính sinh học, hầu hết các vi sinh vật này đến từ môi trường trên cạn. Tuy nhiên việc phát hiện lặp lại với tần suất cao các hợp chất đã biết đã cản trở việc nghiên cứu phát triển thuốc. Trong khi đó hệ sinh thái biển đang ít được khám phá, mặc dù các vi sinh vật biển có khả năng tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học và độc đáo về cấu trúc mà không thể tìm thấy trong các hệ sinh thái trên cạn (Imhoffet al., 2016).
Việt Nam với đường bờ biển dài hơn 3000 km, có hệ sinh thái rất đặc thù và được đánh giá là một trong những khu vực đa dạng sinh học cao của thế giới. Tuy nhiên, việc điều tra nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển ở Việt Nam vẫn còn hạn chế. Để khai thác tiềm năng của vi sinh vật biển cho các mục đích phát triển dược phẩm trong tương lai, trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày kết quả về nuôi cấy, sàng lọc hoạt tính kháng sinh và định danh các chủng xạ khuẩn từ các mẫu sinh vật biển và trầm tích biển thu thập được từ vùng biển đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Hóa chất
Các hóa chất sử dụng cho môi trường được cung cấp từ các hãng Hidia (Ấn Độ), SigmaAldrich (Mỹ), Đức Giang (Việt Nam), Kit tách DNA tổng số của hãng Madison (Mỹ), Dream Taq PCR Master mix của hãng Thermo Scientific, Hàn Quốc, chỉ thị DNA chuẩn (Fisher Scientific), các cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA (16sF: 5'- GAGTTTGATCCTGGCTCAG3'; 16sR: 5'- AAGGAGGTGATCCAACC3'). 
Các chủng vi sinh vật kiểm định
Gồm các chủng sau: 3 chủng vi khuẩn Gram âm (E. coli ATCC25922, P. aeruginosa ATCC27853, S. enterica ATCC13076), 3 chủng vi khuẩn Gram dương (E. faecalis ATCC29212, S. aureus ATCC25923, B. cereus ATCC 14579), 1 chủng Nấm men C. albicans ATCC10231 (Microbiologics, Mỹ). 
Môi trường
Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu được tham khảo bởi Stanley và Holt (1989) có cải tiến của Khoa Hoá dược phẩm và Dược liệu học, Đại học Dược, Đại học Illinois Chicago. Môi trường A1: tinh bột tan 10 g/L, cao nấm men 4 g/L, pepton 2 g/L, muối biển nhân tạo 30 g/L, thạch agar 15 g/L); môi trường M1: tinh bột tan 5 g/L, cao nấm men 2 g/L, pepton 1 g/L, muối biển nhân tạo 30 g/L, thạch agar 15 g/L; môi trường SWA: muối biển nhân tạo 30 g/L, thạch agar 15 g/L; môi trường SCA: muối biển nhân tạo 10 g/L, K2HPO4 2 g/L, KNO3 2 g/L, casitone 0,3 g/L , MgSO4·7H2O 50 mg/L, FeSO4·7H2O 10 mg/L, CaCO3 2 mg/L, thạch agar 15 g/L, muối biển nhân tạo 30 g/L; môi trường NZSG: tinh bột tan 20 g/L, cao nấm men 5 g/L, glucose 10 g/L, NZ Amine A 5 g/L, muối biển nhân tạo 30 g/L, thạch agar 15 g/L; môi trường ISP1: muối biển nhân tạo 5 g/L, cao nấm men 2 g/L, casitone 5 g/L, muối biển nhân tạo 30 g/L, thạch agar 15 g/L; môi trường ISP2: tinh bột tan 5 g/L, cao nấm men 2 g/L, cao mạch nha 10 g/L, glucose 10 g/L, muối biển nhân tạo 30 g/L, thạch agar 15 g/L.
Các mẫu sinh vật và trầm tích biển đã thu thập 
80 mẫu sinh vật và trầm tích biển được thu thập tại các tọa độ và độ sâu khác nhau (từ 3 – 16 m) thuộc vùng biển Lý Sơn, Quảng Ngãi. Mẫu được lưu giữ trong các ống Eppendorf và facol vô trùng, được bảo quản lạnh trong thời gian vận chuyển và được tiến hành phân lập trong 24h. 
Phương pháp nghiên cứu
Phân lập các chủng xạ khuẩn
Cân 0,5 g mẫu vào ống fancol, sau đó bổ sung 4,5 mL nước cất vô trùng (dùng thanh inox vô trùng để nghiền mẫu nếu là mẫu sinh vật biển), đảo đều mẫu và tiến hành sốc nhiệt ở nhiệt độ 60oC trong 8 phút, hút 50 µL dịch trong ống đã được sốc nhiệt vào một ống Eppendorf khác có chứa 450 µL nước cất đã khử trùng, tiếp tục trộn đều mẫu và hút 50 µL dịch cấy trải vào các đĩa có chứa 7 loại môi trường đã chuẩn bị (A1, M1, SWA, NZSG, SCA, ISP1, ISP2). Các đĩa được nuôi trong tủ ấm ở 28 - 30oC sau 7 - 30 ngày lựa chọn các khuẩn lạc cấy chuyển làm sạch sang môi trường ISP2.
Tạo cặn chiết thô từ dịch nuôi cấy
Các chủng xạ khuẩn được nuôi trong các bình tam giác 1000 mL có chứa 500 mL môi trường A1, ở điều kiện 28oC lắc 170 vòng/phút. Sau 7 ngày nuôi cấy, dịch nuôi được chiết với 300 mL ethyl acetate (5 lần × 15 phút). Chất chiết xuất sau đó được làm bay hơi dưới áp suất giảm (250 mbar, bể gia nhiệt ở 45oC) để loại dung môi thu chất chiết xuất thô (Cédric et al., 2013).
Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định theo phương pháp pha loãng đa nồng độ của Hadacek và Greger (2000). Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu). Mẫu chiết thô ban đầu được pha loãng trong DMSO và các kháng sinh được pha trong nước cất vô trùng ở dải nồng độ giảm dần 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 và 2 µg/mL với số thí nghiệm lặp lại N = 3. Bổ sung 50 µL dung dịch vi khuẩn và nấm kiểm định ở nồng độ 2 x 105 CFU/mL, ủ ở 37oC. Sau 24 h, đọc giá trị MIC là giá trị tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật kiểm định. Đối chứng là kháng sinh streptomycin cho các chủng vi khuẩn và cycloheximide cho nấm men.
Phương pháp định danh các chủng xạ khuẩn
Các chủng xạ khuẩn sau khi sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch (ISP2) ở 30ºC trong 14 ngày và quan sát bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét SEM (scanning electron microscopy) model JSM-5410 LV, JEOL. Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn được xác định dựa trên các đặc điểm nuôi cấy bao gồm: màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, hình thái khuẩn lạc (Arai, 1975; Trerner et al., 1963).
Phản ứng khuyếch đại gen 16S rRNA được thực hiện trong một thể tích hỗn hợp 25 µL chứa: 10 µL H2O khử ion vô trùng, 12,5 µL PCR Master mix, 1,0 µL mồi với nồng độ 0,05 mM cho mỗi mồi 16sF và16sR, 0,5 µL DNA tổng số. Chu trình nhiệt của PCR là: 94oC/2 phút (94oC/1 phút, 58oC/1 phút, 72oC/1 phút 20 giây) x 30 chu kỳ, 72oC/ 8 phút và giữ mẫu ở 8oC. Kích thước sản phẩm theo lý thuyết khoảng 1500 bp. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng kit tinh sạch của hãng Invitrogen. Trình tự gen 16S rRNA được giải mã bằng máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 của hãng Bioscience. Trình tự được xử lý bởi chương trình BioEdit v.2.7.5. và so sánh với dữ liệu ngân hàng gen của NBCI. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng chương trình MEGA version 4.1.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn các chủng xạ khuẩn 
Từ 80 mẫu sinh vật và trầm tích biển thu thập ở đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi (gồm 11 mẫu trầm tích, 9 mẫu thân mềm, 11 mẫu san hô mềm, 15 mẫu Rong, 8 mẫu Hải miên, 26 mẫu da gai) được tiến hành phân lập theo phương pháp đã trình bày, đã phân lập làm sạch và lưu giữ được 61 chủng xạ khuẩn.
Các chủng sau đó được tiến hành nuôi cấy trong môi trường A1, dịch nuôi cấy được chiết với dung môi ethyl acetate (5 lần) thu được cặn chiết. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn từ cặn chiết của các chủng xạ khuẩn cho thấy: 44/61 chủng phân lập đều có hoạt tính ức chế từ 1 đến 5 chủng VSVKĐ, trong đó có 18 chủng phân lập có hoạt tính ức chế từ 3 chủng VSVKĐ trở lên. Ngoài ra, chỉ có 9/61 chủng phân lập có hoạt tính kháng VSVKĐ Gram âm. Nguyên nhân về mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm và Gram dương khác nhau là do sự khác biệt về cấu trúc của thành tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn Gram âm có màng ngoài gồm các thành phần lipopolysaccharide, đặc biệt hàm lượng lipid và lipoprotein cao, Cấu trúc này giúp cho thành tế bào khó bị tác động. Trong khi đó, các chủng Gram dương nhạy cảm với kháng sinh hơn do chỉ có một lớp peptidoglycan bên ngoài, cấu trúc này không phải là một hàng rào ngăn cản hiệu quả sự thấm thấu của kháng sinh cũng như các tác nhân bên ngoài vào thành tế bào (Basilio et al., 2003; Oskay et al., 2004).
Hình 1. Một số hình ảnh trong quá trình thu thập mẫu.
Hình 2. Một số hình ảnh trong quá trình phân lập xạ khuẩn từ các mẫu thu thập.
Từ kết quả sàng lọc, chúng tôi đã lựa chọn 3 chủng (G330 được phân lập từ mẫu thân mềm, G336 được phân lập từ mẫu trầm tích và G361 được phân lập từ mẫu rong biển) có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất, ức chế 5/7 chủng VSVKĐ. Ba chủng này đều có khả năng ức chế cả 3 chủng VSVKĐ Gram dương (E. faecalis ATCC29212, S. aureus ATCC25923, B. cereusATCC 14579) với các giá trị MIC từ 4 đến 256 µg/mL. Trong khi đó chủng G330 và G336 chỉ ức chế 1 chủng Gram âm là S. enterica ATCC13076; chủng G361 ức chế khá mạnh chủng E. coli ATCC25922 với giá trị MIC là 8 µg/mL (so với MIC của kháng sinh đối chứng streptomycin là 32 µg/mL). Ngoài ra, 3 chủng G330, G336 và G361 còn ức chế rất tốt nấm C. albicans ATCC10231 với MIC từ 8 - 64 µg/mL (bảng 1). Hoạt tính này rất đáng quan tâm vì C. albicans là tác nhân gây ra nhiều bệnh, đặc biệt là niêm mạc miệng, lưỡi, dạ dày, hành tá tràng, đường ruột, niệu đạo và đường sinh dục. Hiện nay C. albicans trở nên khó kiểm soát do đã đề kháng với các kháng sinh chống nấm hiện có như amphotericin B, vaclotrimazole, 5-fluorocytosine... (Nguyễn Vĩnh Hà et al., 2002).
Bảng 1. Giá trị MIC (µg/mL) của cặn chiết ethyl acetate của 3 chủng có hoạt tính đã lựa chọn
Định danh 3 chủng đã sàng lọc Ba chủng xạ khuẩn G330, G336 và G361 được nuôi cấy trong 14 ngày ở 30ºC trên môi trường thạch (ISP2), kết quả cho thấy sợi khuẩn ty cơ chất phát triển tốt trên nền cơ chất của môi trường, nhưng sợi khuẩn ty khí sinh thì yếu hơn. Màu sắc của các sợi khí sinh rất phong phú, từ vàng (G336), trắng chuyển dần sang nâu đỏ ở viền khuẩn lạc (G330) và màu cam nâu (G361). Quan sát hình thái bào tử của ba chủng xạ khuẩn dưới kính hiển vi điện tử SEM cho thấy G330 có bào tử được sinh ra đơn lẻ và kết thành chuỗi, có đường kính khoảng 0,5 - 1 µm. Chủng G336 và G361 có các bào tử ở dạng nốt và mịn trên bề mặt và không di chuyển được (Hình 3). Các đặc điểm này được coi là những đặc điểm quan trọng hỗ trợ trong việc định loài vi sinh vật (Mukherjee et al., 2004; Maruyama et al., 1975).
Ba chủng có hoạt tính kháng VSVKĐ cao và có tiềm năng ứng dụng đã được định danh dựa trên so sánh trình tự gen 16S rRNA bằng chương trình Blast. Các gen 16S rRNA được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi 16sF và 16sR đã nêu, tạo ra các sản phẩm tính theo lý thuyết khoảng 1500 bp (Hình 4). Các sản phẩm PCR được tinh sạch, giải trình tự và phân tích bằng phần mềm Bioedit. So sánh các trình tự 16S rRNA của ba chủng nghiên cứu với các trình tự trong cơ sở dữ liệu của GenBank, kết quả cho thấy các chủng này có độ tương đồng cao (hơn 99%) về trình tự gen 16S rRNA so với các chủng đã công bố trên GenBank. Nghiên cứu quan hệ của các chủng trên cây phát sinh loài cho thấy chủng G330 thể hiện sự tương đồng cao với chi Streptomyces, chủng G336 và G361 có độ tương đồng cao với chi Salinispora (Hình 5).
Streptomyces là chi thuộc họ Streptomycetaceae, là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria. Mặc dù chi Streptomyces là một chi rất phổ biến trong đất, nhưng các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy nhóm vi sinh vật này đã thích nghi và phát triển ở môi trường biển. Cho đến ngày nay, các thành viên của chi Streptomyces chịu trách nhiệm sản xuất phần lớn các chất chuyển hóa thứ cấp từ nguồn vi sinh vật thu thập được ở đại dương. Nhiều hợp chất thứ cấp có cấu trúc thú vị và độc đáo từ nguồn vi sinh vật biển có thể là hiếm khi xuất hiện hoặc hoàn toàn chưa từng thấy từ các nguồn vi sinh vật trên cạn (Khan et al., 2011).
Hình 3. Hình thái khuẩn lạc của chủng G330 (A) G336 (B) và G361 (C) được nuôi trên môi trường ISP2 vàhình ảnh bào tử dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) của G330 (D) G336 (E) và G361 (F) ở độ phóng đại 1000x
Hình 4. Ảnh Điện di sản phẩm PCRgen 16S rRNA của ba chủng nghiên cứu. M: thang ADN chuẩn 1Kb của Fisher Scientific. 1-3: Sản phẩm PCR của các chủng G330, G336 và G361.
Từ các mẫu trầm tích thu thập được ở bờ biển phía tây Banten, Sunaryanto et al., (2010) đã phân lập được 29 chủng xạ khuẩn, trong đó chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. A11 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất. Bằng các phương pháp hóa học, từ chủng Streptomyces sp. A11 đã tách được một hợp chất tinh khiết có hoạt tính kháng khuẩn khá tốt với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ở E. coli ATCC 25922 là 27 µg/mL, P. aeruginosa ATCC 27853 là 68,7 µg/mL, S. aureus ATCC 25923 là 80,2 µg/mL và B. subtilis ATCC 66923 là 73,7 µg/mL, thấp hơn nhiều so với chất kháng sinh đối chứng là tetracyline.
Từ chủng xạ khuẩn Pseudonocardia sp. SCSIO-01299 phân lập từ trầm tích được thu thập ở độ sâu 3258 m, thuộc biển Đông. Sumei et al., 2011 đã tách được 4 hợp chất có hoạt tính sinh học tốt đó là deoxynyboquinone và pseudonocardian A-C. Deoxynyboquinone và pseudonocardian A và B thể hiện hoạt tính kháng S. aureus ATCC 29213, E. faecalisATCC 29212, B. thuringensis SCSIO BT01 với các giá trị MIC trong khoảng từ 1 - 4 µg/mL, và hoạt tính ức chế tế bào ung thư phổi SF-268, ung thư vú MCF-7 và ung thư não NCI-H460 với các giá trị IC50 trong khoảng từ 0,01 đến 0,21 µm.
Một nghiên cứu khác của (Cheng et al., 2017), từ chủng Streptomyces sp. SBT348 phân lập được từ hải miên Petrosia ficiformis thuộc vùng biển Địa Trung Hải, đã tách được hợp chất petrocidin A và 2,3-dihydroxybenzamide. Hai hợp chất này biểu hiện độc tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư HL-60 và HT-29 với giá trị IC50 là 3,9 và 5,3 µg/ml tương ứng. 
Chi Salinispora được phân lập từ trầm tích biển và được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1989. Vào thời điểm đó, các đặc điểm về hình thái và hóa học của chúng cho thấy chúng là họ hàng gần của chi Micromonospora và chúng được đề xuất các loài trong chi này. Các nghiên cứu phát sinh gen sau đó đã đặt các xạ khuẩn này vào một nhánh khác với Micromonosporae, và chúng được đề xuất là đại diện cho một chi mới là “Salinospora”. Đến năm 2005 chi này được mô tả chính thức và chi với tên được sửa đổi thành Salinispora và có 3 loài S. tropica, S. arenicola và S. pacifica được mô tả chính thức (Paul et al., 2015).
Hình 5. Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối liên quan giữa ba chủng nghiên cứu với các thành viên đại diện của các chi Streptomyces và Salinispora dựa trên trình tự gen 16S rRNA. Cây được dựng theo phương pháp neighbor – joining, các chỉ số hiển thị ở các vị trí phân nhánh là kết quả phân tích bootstrap đối với 1000 phép so sánh (chỉ có các giá trị trên 50% được trình bày).
Các hợp chất đầu tiên được mô tả từ chi Salinispora là lomaiviticins A và B (He et al., 2001). Vào thời điểm đó, chủng đã được báo cáo là một loài mới thuộc chi Micromonospora với tên được đề xuất là Micromonospora lomaivitiensis. Tuy nhiên, phân tích trình tự gen 16S rRNA sau đó đã xác định chủng này là S. pacifica (Janso et al., 2014). Ở một nghiên cứu khác của Williams et al. (2007) từ chủng S. arenicola CNR-059 đã phân lập được các hợp chất saliniketals A và B. Hai hợp chất này thể hiện hoạt tính ức chế ornithine decarylase, một mục tiêu quan trọng để ngăn ngừa ung thư với các giá trị IC50 tương ứng là 1,95 và 7,83 µg/mL. Một loại kháng sinh mới là salinisporamycin thuộc nhóm rifamycin, cũng đã được báo cáo từ chủng S. arenicola có nguồn gốc trầm tích biển (Matsuda et al., 2009). Trong một nỗ lực khám phá kháng sinh mới từ các chủng thuộc chi Salinispora sp., nhằm chống lại chủng vi khuẩn kháng thuốc S. aureus kháng methicillin (MRSA), Asolkar et al. (2010) đã phân lập được một kháng sinh mới thuộc nhóm kháng sinh benzo [α] naphthacene là arenimycin A từ chủng S. arenicola CNR-647. 
KẾT LUẬN 
Từ 80 mẫu sinh vật và trầm tích biển thu thập được ở vùng biển đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi, đã phân lập được 61 chủng xạ khuẩn, lựa chọn được 3 chủng xạ khuẩn (G330, G336 và G361) có hoạt tính cao nhất, ức chế 5/7 chủng VSVKĐ. Các chủng được chọn đều có khả năng ức chế cả 3 chủng vi khuẩn Gram dương (E. faecalis ATCC29212, S.aureus ATCC25923, B cereus ATCC 13245) với các giá trị MIC từ 4 µg/mL đến 256 µg/mL. Chủng G330 và G336 chỉ ức chế 1 chủng vi khuẩn Gram âm là S. enterica ATCC13076, chủng G361 ức chế khá mạnh chủng E. coli ATCC25922 với giá trị MIC là 8 µg/mL. Ngoài ra, 3 chủng G330, G336 và G361 còn ức chế rất tốt nấm C. albicans ATCC10231 với MIC từ 8 - 64 µg/ml. Các chủng đã được xác định hình thái và định danh bằng trình tự gen 16S rRNA. Kết quả cho thấy, 16S rRNA của các chủng có độ tương đồng cao hơn 99% so với các trình tự gen 16S rRNA trên ngân hàng gen quốc tế. Chủng G330 thuộc chi Streptomyces; hai chủng G336 và G361 được xác định là thành viên của chi Salinispora.
Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự tài trợ kinh phí từ đề tài mã số VAST. TĐ. ĐAB.04/ 16-18 của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
Arnold LD, Sergio S (2009) Microbial drug discovery: 80 years of progress. J Antibiotics 62: 5-16. Arai T (1975) Culture Media for Actinomycetes. The Society for Actinomycetes Japan, Tokyo: 1-31. 
Asolkar RN, Kirkland TN, Jensen PR, Fenical W (2010) Arenimycin, an antibiotic effective against rifampin- and methicillin-resistant Staphylococcus aureus from the marine actinomycete Salinispora arenicola. J Antibiot 63:37-39.
DOI:10.1038/ja.2009.114
Basilio A, González I, Vicente MF, Gorrochategui J, Cabello A, González A, Genilloud O. (2003) Patterns of antimicrobial activities from soil actinomycetes isolated under defferent conditions of pH and salinity. J Appl Microbiol 95: 814-823.
Cédric O, Skylar C, Bindiya K, Mashal MA, Haipeng L, Anna O, Quan S, Van Cuong Pham, Catherine LS, Brian TM, Alexander SM (2013) Tool for characterizing bacterial protein synthesis inhibitors. Antimicrob Agent Chemother 57: 5994-
6002.
Chen L, Todd R, Kiehlbauch J, Walters M, Kallen A(2017) Notes from the Field: PanResistant New Delhi metallo-beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae - Washoe County, Nevada, 2016. Morb Mortal Wkly Rep 66(1): 33. 
Cheng C, Eman M (2017)Isolation of Petrocidin A, a new cytotoxic cyclic dipeptide from the marine sponge-derived bacterium Streptomyces sp. SBT348. Mar Drugs 15(12):383 https://doi.org/10.3390/md15120383
Goodfellow M, Davenport R, Stainsby FM, Curtis TP (1996) Actinomycete diversity associated with foaming in activated sludge plants. Microbiol Biotechnol J Ind 17: 268-280.
Hadacek F, Greger H (2000) Test of antifungal natural products methodolagies, comparability of result and assay choise. Phytochem Anal 90: 137- 147.
He H, Ding WD, Bernan VS, Richardson AD, Ireland CM, Greenstein M, Ellestad GA, Carter GT (2001) Lomaiviticins A and B, potent antitumor antibiotics from Micromonospora lomaivitiensis. J Am Chem Soc 123:5362–5363.
Imhoff JF (2016) Natural products from marine fungi-Still an underrepresented resource. Mar Drugs 14(1): 19 https://doi.org/10.3390/md14010019. 
Janso JE, Haltli BA, Eustáquio AS, Kulowski K, Waldman AJ, Zha L, Nakamura H, Bernan VS, He H, Carter GT, Koehn FE, Balskus EP (2014) Discovery of the lomaiviticin biosynthetic gene cluster in Salinispora pacifica.Tetrahedron 70:4156-
4164. DOI: 10.1016/j.tet.2014.03.009.
Khan ST, Komaki H, Motohashi K, Kozone I, Mukai A, Takagi M, Shin-ya K (2011) Streptomyces associated with a marine
sponge Haliclona sp. biosynthetic genes for secondary metabolites and products. Environ Microbiol Black Sci Pub13: 391-403 
Matsuda S, Adachi K, Matsuo Y, Nukina M, Shizuri Y (2009) Salinisporamycin, a novel metabolite from Salinispora arenicora. J Antibiot 62:519–526. DOI: 10.1038/ja.2009.75
Maruyama HB, Suhara Y, Suzuki W, Maeshima Y, Shimizu MA (1975) New antibiotic fumaramidmycin I- Production, biological properties and characterization of producer strain. J Antibiot 28: 636–647.
Mukherjee G, Sen SK (2004) Characterization and identification of chitinase producing Streptomyces venezulae P10. J Exp Biol Indian 42: 541–544.
Nguyễn Vĩnh Hà (2002), Khảo sát họat tính đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn khu vực Giao Thủy, Nam Định và Thái Thụy, Thái bình, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội: 5- 30.
Oskay M, Same A, Azeri C (2004) Antibacterial activity of some actinomycetes isolated from farming soils of Turkey. Afr J Biotechnol 3: 441-456.
Paul R J, Bradley SM, William F (2015) The marine actinomycete genus Salinispora: A model organism for secondary metabolite discovery. Nat Prod Rep 32(5): 738–751.doi: 10.1039/c4np00167b Powers JH (2004) Antimicrobial drug developmentthe past, the present, and the future. Clin Microbiol Infect 10(4): 23–31.
Sunaryanto R, Marwoto B (2010) Marine actinomycetes screening of Banten west coast and their antibiotics purification. Biodiversitas 11(4): 176-181
Sumei L, Tian X, NiuS, Zhang W, ChenY (2011) Pseudonocardians A-C Pseudonocardians A-C, New diazaanthraquinone derivatives from a deap-sea actinomycete Pseudonocardia sp. SCSIO 01299. Marine Drugs9:1428-1439.
Trerner HD, Buckus EJ (1963) System of color wheels for Streptomyces taxonomy. Appl Microbiol 11: 335 – 338.
WHO (2014) Antimicrobial resistance: global report on surveillance. Switzerland: World Health Organization.
Williams PG, Asolkar RN, Kondratyuk T, Pezzuto JM, Jensen PR, Fenical W (2007) Saliniketals A and B, bicyclic polyketides from the marine actinomycete Salinispora arenicola.J Nat Prod 70:83–88. DOI:10.1021/np0604580.
SCREENING AND IDENTIFICATION OF ACTINOMYCETES HAVING ANTIMICROBIAL ACTIVITY ISOLATED FROM MARINE ORGANISMS AND
SEDIMENT SAMPLES IN LY SON ISLAND, QUANG NGAI
SUMMARY
The discovery of bioactive compounds from marine microorganisms for drug development has been currently widely studied. In which marine actinomycetes are highlighted as a potential source in finding antibiotics as well as substances with biological activity in general. The objective of this study is to isolate and screen the actinomycetes strains with antibacterial activity from the marine environment. Sixty one actinomycetes were isolated from 80 samples of marine organisms and sediments collected from Ly Son Island, Quang Ngai. The strains were fermented in the A1 medium and the culture broths were extracted by ethyl acetate and vacuum rotary evaporation to produce crude extracts. Antimicrobial activity of the extracts were carried out on 7 strains of tested microorganisms, including three strains of Gram-negative bacteria (Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella enterica ATCC13076), three Gram-positive strains (Enterococcus faecalis ATCC29212, Staphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC 13245), and yeast Candida albicans ATCC10231. The screening results showed that three strains with the highest antimicrobial activity (G330, G336 and G361) were capable of inhibiting 5 of the 7 tested microorganisms with Minimum Inhibitory Concentration (MIC) values ranging from 4 to 256 µg/mL, depending on each tested strain. Specifically, all three strains inhibited C. albicans ATCC10231 and three Gram-positive strains (E. faecalis ATCC29212, S. aureus ATCC25923, B. cereus ATCC 13245). In addition, G330 and G336 also showed the inhibitory activity to Gram negative strain S. enterica ATCC13076 with value of 256 µg/mL, G361 has a good inhibitory ability for E. coli ATCC25922 with MIC value of 8 µg/mL. The strains were identified by morphological and the 16S rRNA gene sequences. The results showed that 16S rRNA sequences of the strains had over 99% similarity to the 16S rRNA sequences on the GeneBank database, strains G336 and G361 belonged to the genus Salinispora, whereas strain G330 belonged to the genus Streptomyces. These results showed that marine environment has a great potential in solation of actinomycetes strains for the search for antibacterial substances as well as other biologically active compounds.
Keywords: actinomycetes, antimicrobial activity, MIC, 16S rRNA gene sequences
Trần Thị Thanh Hoa1,2,3, Lê Thị Hồng Minh1, Vũ Thị Quyên1, Nguyễn Mai Anh1, Đoàn Thị Mai Hương1, Châu Văn Minh1, Phạm Văn Cường1 
1 Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 
2 Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương
3 Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1), 2020
Tổng số lượt truy cập :
  • 1
  • 6
  • 5
  • 1
  • 8
  • 7
  • 8
lên đầu trang