Staphylococcus aureus là tác nhân phổ biến gây nhiễm trùng bệnh viện cũng như trong cộng đồng dân cư với tỷ lệ mắc và tử vong cao trên toàn thế giới. S. aureus khi nhiễm độc thức ăn, đồ uống do tiếp xúc giữa người mang mầm bệnh sẽ có thể dẫn đến viêm ruột cấp do các thức ăn có chứa độc tố ruột của S. aureus, gây mất nước và điện giải có thể dẫn tới sốc. S. aureus là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Những chủng S. aureus gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường có khả năng kháng lại nhiều kháng sinh. S. aureus còn gây hội chứng sốc nhiễm độc do tiết ra độc tố gây sốc. Theo một số cơ quan quản lý thực phẩm châu Âu, các vi sinh vật gây bệnh phổ biến có nguồn gốc từ thực phẩm bao gồm Salmonella, Escherichia coli O157:H7, S. aureus và Listeria cùng với một số loài khác (CDC, 2011; EFSA, 2009). Sử dụng các chất hóa học để bảo quản thực phẩm ít được chấp nhận vì nhiều chất bảo quản hóa học đã làm ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng. Trong số các chất bảo quản sinh học được biết hiện nay, endolysin hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học do nó có khả năng diệt và ức chế các vi sinh vật gây bệnh.

Endolysins (hay tên gọi khác là lysins) là các enzym thủy phân có nguồn gốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối chu trình sinh sản của thực khuẩn thể. Do đó khi có mặt endolysins chúng có thể phân hủy lớp peptidoglycan của thành tế bào của vi sinh vật khi chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết, do vậy chúng được coi như là một chất kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc, không thay đổi đặc điểm cảm quan, kết cấu của thực phẩm và rất an toàn cho con người.

Lysin đáp ứng tất cả các điều kiện trên và do đó nó được xem là một sự lựa chọn phù hợp để kiểm soát tác nhân gây bệnh trong thực phẩm. Với mục tiêu tạo ra chế phẩm endolysin vào thực tế sản xuất, chế biến thực phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy trình lên men quy mô 80 lít và tạo chế phẩm endolysin có hoạt tính tốt và an toàn.

Chủng vi khuẩn E. coli BL21[pET21b(+-LysSa)] mang gen mã hóa endolysin LysSa29 tái tổ hợp dùng làm chủng biểu hiện protein do phòng Công nghệ Vi sinh, Viện Di truyền Nông nghiệp tạo ra. Thành phần môi trường và các hóa chất cần thiết cho quá trình lên men đều đảm bảo chất lượng.

Từ khuẩn lạc đã được chọn sau thời gian 24 giờ trên môi trường LB agar có chứa ampicillin 100µg/ml, cấy sang môi trường LB lỏng có chứa ampicillin 100µg/ml trong bình tam giác thể tích 1000ml có chứa 200ml môi trường và nuôi ở 37oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút trong thời gian 14-16 giờ. Kiểm tra khả năng sinh trưởng và phát triển bằng đo OD600nm đạt 1,2-1,4 đơn vị, sau đó cấy truyền sang môi trường nhân giống cấp II.

Từ môi trường nhân giống cấp I trong bình tam giác, giống phát triển tốt, được cấy truyền 10% sang môi trường LB để nhân giống cấp II (6,5 lít) trong bình 10 lít ở nhiệt độ 37oC, thổi khí 0.5:1:1 lit/lit/phút, khuấy ở tốc độ 200 vòng/phút, lên men trong 14-16 giờ. Giống đạt tiêu chuẩn thì cấy chuyển sang môi trường lên men 80 lít.

Giống cấp II đạt tiêu chuẩn được dùng cho nồi lên men 110 lít để lên men 80 lít với tỷ lệ tiếp giống là 10 %. Thành phần môi trường gồm:

Sau khi khử trùng môi trường ở 121oC trong 30 phút, môi trường được để nguội, chỉnh pH đến 6,5-7,0 thổi khí để bão hòa oxy trong môi trường lên men. Điều kiện lên men ở nhiệt độ 32oC. Ảnh hưởng của tốc độ thổi khí và tốc độ khuấy được nghiên cứu tối ưu cho điều kiện lên men 80 lít.

a) Ảnh hưởng của tốc độ thổi khí

Chủng vi khuẩn BL21tái tổ hợp được lên men với các tốc độ thổi khí khác nhau: 0,5:1,0:1,5 lít/lít/phút để đánh giá mức độ ảnh của tốc độ thổi khí đến quá trình sinh trưởng của chủng vi khuẩn và hoạt độ của protein tái tổ hợp.

b) Ảnh hưởng của tốc độ khuấy

Mức độ ảnh hưởng của tốc độ khuấy khác nhau: 150, 200, 250 vòng/phút đến sinh trưởng và hoạt độ protein tái tổ hợp được xác định khi nuôi chủng vi khuẩn BL21 tái tổ hợp trong môi trường LB tối ưu, pH:7,0, nhiệt độ 32oC, và tốc độ thổi khí 1lít/lít/phút nhằm xác định tốc độ khuấy tốt nhất.

Dịch lên men 80 lít được cô đặc bằng màng lọc tiếp tuyến. Ly tâm dịch sau khi lọc ở 12.000 vòng/phút, 4oC trong 20 phút để thu sinh khối tế bào.

Rửa sinh khối thu được bằng 2 lần với nước cất khử trùng. Mỗi lần rửa, ly tâm ở 8.000 vòng/phút ở 4oC trong thời gian 5 phút nhằm loại bỏ dịch rửa thu sinh khối.

Sinh khối tế bào tươi được pha trong đệm phosphate PBS với tỷ lệ 0,1 g sinh khối tế bào tươi trong 1,0 ml đệm và được phá vỡ bằng siêu âm với tần số 20Hz với chu kỳ 10 giây dừng 10 giây trong 20 phút tại 4oC.

Sau siêu âm toàn bộ dịch endolysin được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút thu dịch enzyme hòa tan chứa endolysin LysSa29 tái tổ hợp, loại bỏ cặn tế bào.

Dịch enzyme thô được đưa qua hệ thống lọc dòng ngang với màng lọc cut off 30kDa, áp suất dòng vào 6 bar, dòng ra 4 bar, tốc độ bơm luân hồi 25v/ph.  Dịch enzyme được lọc luân hồi ở 4oC, cô đặc và kiểm tra hoạt độ enzyme.

Dịch sau quá trình lọc cut off được kiểm tra hoạt tính và phối trộn với sữa gầy và đông khô ở điều kiện -50°C trong thời gian 12-18 giờ để tạo chế phẩm dạng bột. Hoạt độ enzyme của chế phẩm được đánh giá bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Chế phẩm được đóng gói trong túi nylon với trọng lượng khác nhau tùy mục đích sử dụng.

Vi khuẩn S. aureus (vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh ở giai đoạn pha log (OD600nm: 0,6) trên môi trường TSA ở 37oC. Sinh khối tế bào thu lại bằng ly tâm, và hòa loãng trong đệm phosphate (50mM) để đạt số lượng 4,5x106 tế bào trong 4,8ml dung dịch đệm. Chế phẩm enzyme endolysin được hòa trong đệm phosphate (50mM) ở nồng độ 1g/ml, và pha loãng ở các mức độ khác nhau. Mỗi mẫu thí nghiệm gồm 4,8ml dịch khuẩn chỉ thị và 0,2 ml dung dịch chế phẩm đã được pha loãng. Mẫu đối chứng là mẫu không có chế phẩm endolysin. Các mẫu được ủ ở 37oC và cứ sau 5 phút trong 20 phút đầu và mỗi giờ ở các giờ tiếp theo, lấy mẫu cấy trên môi trường MSA để xác định mật độ tế bào chỉ thị.

Hoạt tính endolysin được tính tại độ hòa loãng lớn nhất mà tại đó số lượng tế bào giảm khoảng ½ sau 15 phút phản ứng. Số lượng tế bào bị phân giải theo thời gian trong giai đoạn đầu của phản ứng (15 phút) được dùng để tính số đơn vị enzyme (U) với 1U=3x103 tế bào bị phân giải/phút. Như vậy:

Hoạt độ enzyme (U/ml) được tính bằng công thức sau:

U/ml = U x D x 1/V

Trong đó:
            U: là số đơn vị enzyme
            D: là độ pha loãng
            V: thể tích enzyme dùng cho phản ứng (ml)

Theo các nghiên tối ưu điều kiện lên ở quy mô 5 lít cho thấy endolysin được biểu hiện nhiều ở phần tan của dịch phá tế bào, đồng thời đã tìm được các thông số tối ưu để sinh tổng hợp endolysin có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh S. aureus như: thành phần môi trường tối ưu (pepton: 8 g/l, cao nấm men: 3 g/l và NaCl: 8 g/l), nhiệt độ lên men 32oC, pH:7, chất cảm ứng IPTG 0,1mM. Với mục đích thu được lượng enzyme lớn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, cần nghiên cứu tối ưu các điều kiện nhân nuôi và tinh sạch enzyme endolysin ở quy mô lớn hơn (quy mô 80 lít/mẻ).

Nhằm đánh giá mức độ ảnh của tốc độ thổi khí đến quá trình lên men và biểu hiện protein, chủng vi khuẩn BL21 tái tổ hợp được lên men ở hệ thống 80 lít với các tốc độ thổi khí khác nhau: 0,5:1,0:1,5 lít/lít/phút với các thông số tối ưu khác đã được kiểm tra ở quy mô phòng thí nghiệm. Kết quả thể hiện khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn tái tổ hợp ở các điều kiện thổi khí khác nhau được biểu diễn trên hình 3.1.

Kết quả trên hình 3.1 cho thấy, ở tốc độ thổi khí là 1,5 lít/lít/phút, chủng vi khuẩn tái tổ hợp sinh tổng hợp endolysin có hoạt độ đạt cao nhất (8,26 U/ml). Tuy nhiên cũng không hơn đáng kể so với tốc độ thổi khí là 1 lít/lít/phút (8,52 U/ml). Để giảm giá thành cho chế phẩm endolysin khi ứng dụng vào thực tế thì tốc độ thổi khí là 1 lit/lít/ phút được lựa chọn là tốc độ thổi khí tối ưu cho quá trình lên men trong hệ thống 80 lít.

Để đánh giá ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên quá trình lên men quy mô 80 lít và hoạt độ của enzyme thu được, chủng vi khuẩn BL21 tái tổ hợp được nuôi ở các tốc độ khuấy khác nhau: 150, 200, 250 vòng/phút trong môi trường LB tối ưu, và tốc độ thổi khí 1lít/lít/ phút nhằm xác định tốc độ khuấy tốt nhất trong hệ thống lên men 80 lít.

Ở tốc độ cánh khuấy là 150 và 200 vòng/phút, hoạt tính endolysin ở các thời gian sau cảm ứng đều thấp hơn tốc độ 250 vòng/phút. Ở tốc độ 250 vòng/phút cho hoạt tính endolysin cao nhất (8,52U/ml) sau 5 giờ cảm ứng, đây cũng là tốc độ cánh khuấy tốt nhất cho quá trình lên men 80 lít.

Thí nghiệm sản xuất endolysin LysSa29 quy mô 80 lít được thiết lập dựa trên các thông số tối ưu như: thành phần môi trường (pepton: 8 g/l, cao nấm men: 3 g/l và NaCl: 8 g/l), nhiệt độ 32oC, pH:7, chất cảm ứng IPTG 0,1mM, tốc độ thổi khí: 1 lit/lít/ phút, tốc độ cánh khuấy: 250 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu động thái lên men của chủng vi khuẩn BL21 LysSa29 trên thiết bị lên men dung tích 110 lít để lên men 80 lít  được chỉ ra trên hình 3.3.

Sinh khối tế bào vi khuẩn E.coli tái tổ hợp tăng đều theo thời gian nuôi cấy. Sau 4 giờ nuôi cấy mật độ vi khuẩn đạt OD600nm là 0,5, đây cũng thời gian thích hợp để bắt đầu bổ sung chất cảm ứng. Hoạt tính endolysin LysSa tăng nhanh sau 2 giờ cảm ứng và đạt cực đại sau 6 giờ cảm ứng (24,5 U/ml). Ở các giờ nuôi cấy tiếp theo hoạt tính endolysin đạt trạng thái cân bằng và giảm xuống sau 16 giờ cảm ứng.

Sau 10 giờ lên men (sau 6 giờ bổ sung chất cảm ứng), sinh khối tế bào được thu qua hệ thống lọc tiếp tuyến từ 80 lít giảm xuống còn 3,5 – 4,2 lít. Ly tâm  dịch cô đặc ở 12.000 vòng/phút, 4oC trong 20 phút để thu sinh khối tế bào. Rửa sinh khối tế bào 2 lần trong nước cất vô trùng. Hòa tan 0,1 g sinh khối tế bào tươi trong 1,0 ml đệm PBS. Các tế bào được phá vỡ bằng siêu âm với tần số 20Hz trong 20 phút (chu kỳ 10 giây siêu âm nghỉ 10 giây). Ly tâm dịch đã siêu âm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch enzyme thô và loại bỏ xác tế bào. Dịch enzyme thô (3.500 ml) được đưa qua hệ thống lọc dòng ngang với màng lọc cut off 30kDa với áp suất dòng vào 6 bar, dòng ra 4 bar, tốc độ bơm luân hồi 25v/ph. Dịch enzyme được lọc luân hồi ở 4oC cô đặc đến thể tích cuối là 380 ml. Dịch enzyme endolysin LysSa29 thu được có hoạt tính 3.804.631U/ml và được bảo quản ở 4oC. Hiệu suất của quá trình thu hồi enzym LysSa29 được mô tả tóm tắt trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Tóm tắt thu hồi endolyin LysSa29 tái tổ hợp bằng phương pháp lọc luân hồi.