Thứ sáu, 29/03/2024 | 15:55

Thứ sáu, 29/03/2024 | 15:55

Bài báo khoa học

Cập nhật 09:26 ngày 26/05/2020

Nghiên cứu phân loại vi khuẩn CVS3.3 và khả năng sinh tổng hợp chất kháng nấm Ceratocystis sp. gây bệnh chết héo trên cây keo

TÓM TẮT:
Bệnh chết héo do các loài nấm Ceratocystis sp. gây ra ở các rừng trồng keo và làm giảm nghiêm trọng năng suất gỗ nguyên liệu. Biện pháp kiểm soát sinh học được coi là giải pháp thân thiện với môi trường thay thế cho hóa chất bảo vệ thực vật. Trong nghiên cứu này, chủng CVS3.3 ức chế mạnh nấm bệnh, được xác định đặc điểm sinh học và phân loại. Vi khuẩn CVS3.3 là trực khuẩn Gram dương, phát triển tốt trên hầu hết các môi trường nuôi cấy trong khoảng 15-550C, pH 3-10 và nồng độ muối là 0-6%. Vi khuẩn nghiên cứu có khả năng sinh tổng hợp nhiều enzym ngoại bào. Dựa vào các đặc điểm sinh học và phân tích trình tự gen 16S rDNA, có thể định danh chủng vi khuẩn CVS3.3 là Bacillus subtilis CVS3.3. Trình tự gene 16S rDNA của chủng CVS3.3 đã được đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) với mã số truy cập MT039484. Chủng B. subtilis CVS3.3 sinh tổng hợp chất kháng nấm cao nhất trên môi trường MPA* có pH ban đầu 8,0 ở 370C.
Từ khóa: Bacillus subtilis, Ceratocystis sp., chất kháng nấm, chết héo, phân loại. 
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây keo, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất giấy, tuy phát triển nhanh nhưng cũng chịu tác động của nhiều bệnh hại. Đặc biệt, những năm gần đây xuất hiện bệnh chết héo và sùi vỏ cây trên cây keo do nấm Ceratocystis spp. gây ra tại các vùng trồng keo. Loài nấm này gây chết trắng cho keo non và keo 3-4 năm tuổi, làm sụt giảm nghiêm trọng năng suất gỗ keo xuống chỉ còn dưới 15 m3/ha/năm, hơn nữa, xu hướng lây lan của bệnh diễn ra nhanh và ngày càng gây hại nặng hơn [2].
Để kiểm soát dịch bệnh do nấm Ceratocystis sp. gây ra cần có cách tiếp cận tổng hợp như lựa chọn giống kháng bệnh, giảm thiểu gây ra những vết thương trên cây trong quá trình trồng trọt và chăm sóc. Việc sử dụng các tác nhân hóa học có thể kiểm soát hiệu quả nấm bệnh nhưng dẫn đến ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng sức khỏe con người và gia tăng hiện tượng kháng thuốc. Biện pháp kiểm soát sinh học được coi là giải pháp thân thiện với môi trường thay thế cho hóa chất bảo vệ thực vật [9]. Vi sinh vật có cơ chế đối kháng với nấm bệnh như cạnh tranh dinh dưỡng, sinh enzyme phân hủy thành tế bào của nấm hoặc chất kháng sinh. Thông thường, một chủng có hoạt tính đối kháng với một loại nấm bệnh nhất định, nhưng cũng có thể đồng thời kháng một vài loại khác. Do đó, đối với một loại nấm gây bệnh cụ thể, cần tuyển chọn được các chủng vi sinh vật đối kháng và đánh giá tiềm năng ứng dụng của chúng [3, 4].
Trong bài báo này, các chủng vi khuẩn đối kháng nấm Ceratocystis sp. gây bệnh chết héo trên cây keo (Acacia sp.) ở Việt Nam, được phân lập từ Nhà máy Giấy Bãi Bằng, nghiên cứu đặc điểm phân loại cũng như lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng CVS3.3 nhằm sử dụng trong kiểm soát sinh học bệnh chết héo trên cây keo.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn được phân lập từ Nhà máy Giấy Bãi Bằng. Chủng nấm kiểm định Ceratocystis sp. nhận từ Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng, Viện Khoa học lâm nghiệp Việt Nam.
Môi trường nuôi cấy và phân loại: Môi trường MPA (g/l): Cao thịt, 5; Pepton, 10; NaCl, 5; Nước cất vừa đủ 1 lít; pH 7.
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học theo William và Whitman (2009) [12].
Tách chiết DNA tổng số của chủng CVS3.3 theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001) [11] và gen 16S rDNA được khuếch đại bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi 27F:5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3' và 1492R:5'-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3'. Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra, tinh sạch và phân tích trên máy đọc trình tự ABI PRISM 3100, xử lý bằng phần mềm BioEdit. Sử dụng chương trình BLAST đánh giá mức độ tương đồng gen 16S-rDNA của chủng CVS3.3 với các trình tự gen trong GenBank (NCBI). Cây phả hệ 
được thiết lập trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Kimura bằng việc sử dụng phương pháp Neighbor-joining.
Khảo sát khả năng đối kháng bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch [1].
Nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng khuẩn của chủng CVS3.3: Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong các môi trường cơ bản như MPA, MPA* (MPA với glucose thay cho cao thịt), LB, LB* (LB với pepton thay cho trypton), NB (Nutrient Broth) và KB (King's B). Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ và pH được nghiên cứu trong dải nhiệt độ 25 - 450C và pH 6 - 9. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 250ml chứa 50 ml dịch môi trường, bổ sung 0,5 ml dịch nhân giống 24 giờ (mật độ 108 CFU/ml) nuôi cấy trên máy lắc tròn với tốc độ 150 vòng/phút. Sau 3 ngày, hoạt tính kháng nấm được xác định theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
Các kết quả thu được là các giá trị trung bình, được xử lý theo phương pháp thống kê, sử dụng phần mềm thống kê phân tích dữ liệu Excel 2010 để tính toán.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Khả năng đối kháng Ceratocystis sp. của các vi khuẩn phân lập
Từ 15 mẫu đất đã phân lập và thuần khiết được 52 chủng vi khuẩn, trong số đó có 12 chủng có khả năng đối kháng Ceratocystis sp. Đặc biệt chủng vi khuẩn CVS3.3 (được phân lập từ bùn thải tại khu vực thu hồi lignin của Nhà máy Giấy Bãi Bằng) thể hiện khả năng đối kháng Ceratocystis sp. mạnh nhất, đường kính vòng kháng nấm đạt 16mm (Bảng 1 và Hình 1a).
Bảng 1. Khả năng ức chế nấm Ceratocystis sp. của các chủng vi khuẩn
Trên đĩa kiểm tra, phần sợi nấm gần vùng tiếp giáp với các chủng vi khuẩn đối kháng bị co lại có biểu hiện khô và chết dần, quan sát mặt sau sợi nấm bị đổi sang màu sẫm (Hình 1c).
Đặc điểm sinh học của chủng CVS3.3
Đặc điểm hình thái
Kết quả nghiên cứu môt số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng CVS3.3 cho thấy chủng vi khuẩn CVS3.3 có khuẩn lạc tròn không đều, kích thước 1 - 1,5mm, có màu trắng sữa sau 2 ngày, màu trắng vàng sau 5 ngày, bề mặt không bóng, mép răng cưa. Tế bào hình que, Gram (+), có khả năng di động và sinh bào tử.
Hình 1: Khả năng ức chế Ceratocystis sp. của các chủng vi khuẩn (a,b,c), đĩa nấm bệnh đối chứng (d)
Hình 2: Hình thái vi khuẩn CVS3.3: Hình thái khuẩn lạc (a); Hình thái tế bào (b)
Đặc điểm sinh lý-sinh hóa của chủng CVS3.3
Chủng CVS3.3 có khả năng đồng hóa nhiều loại đường, phát triển tốt trên các môi trường có bổ sung D-glucose, D-xylose, D-mannitol, D-fructose, saccarose, raffinose, sorbitol và trehalose nhưng không phát triển trên môi trường có L- rhamnose và lactose. Chủng CVS3.3 sinh trưởng trong dải nhiệt độ 15^500C nhưng tốt nhất ở 28^300C. Có thể kết luận chủng này thuộc nhóm ưa ấm (mesophilic). Chủng phát triển được trên môi trường có dải pH 3^10, phát triển tốt nhất ở pH 6-7. Chủng có thể’ chịu được nồng độ NaCl tới 6% (w/v) và có khả năng sinh tổng hợp một số enzym ngoại bào như catalase, cellulase, amylase, protease và xylanase.
Định tên chủng CVS3.3
Gen 16S rDNA của chủng CVS3.3 có độ tương đồng (99%) so với gen tương ứng của một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus (Hình 4) như: Chủng Bacillus subtilis CP14 (MN960273), chủng B. subtilis MSP5 (CP046047) và chủng B. subtilis NBRC13719 (AP019714).
Đối chiếu các đặc điểm phân loại của chủng CVS3.3 và kết hợp so sánh trình tự gen 16S rDNA, chúng tôi cho rằng, chủng vi khuẩn CVS3.3 có các đặc điểm rất gần gũi và có độ tương đồng cao với loài Bacillus subtilis. Vậy nên chủng CVS3.3 được đặt tên là B. subtilis CVS3.3. Trình tự gen 16S rDNA của chủng CVS3.3 đã được đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) với mã số truy cập là MT039484. Vi khuẩn Bacillus subtilis thường được sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học trong công tác phòng trừ tác hại của nấm bệnh trên thực vật. Theo Mezzomo và cộng sự (2019), trong điều kiện in vivo, vi khuẩn B. subtilis có hiệu quả đối kháng trực tiếp với nấm Ceratocystis fimbriata gây bệnh trên cây keo đen (Acacia mearnsii De Wild.) [6]. Trước đó, năm 2018, theo nhóm nghiên cứu của Sajitha, chủng B. subtilis B1 có thể được sử dụng nhằm kiểm soát sinh học toàn diện các nấm gây bệnh như Ceratocystis sp., Fusarium sp., Aspergillus sp., Penicllium sp. và Trametes versicolor [10].
Hình 3: Mối quan hệ di truyền của chủng CVS3.3 với các chủng đại diện GenBank qua phân tích trình tự nucleotide đoạn 16S rDNA 
Ảnh hưởng của thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng CVS3.3
Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng nấm (CKN) chịu ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy. Môi trường thích hợp là môi trường giúp chủng vừa có khả năng sinh trưởng tốt vừa sinh ra các sản phẩm mong muốn với hiệu suất tối ưu. Chủng B. subtilis CVS3.3 sinh trưởng và sinh CKN kém trên các môi trường MPA, LB*, NB và KB. Trên hai môi trường LB và MPA*, sau 3 ngày, chủng sinh trưởng tốt và đạt cao nhất trên LB (OD600nm s 6,2). Tuy nhiên hoạt tính kháng nấm thu được cao nhất trên môi trường MPA*, đường kính vòng kháng nấm (VKN) đạt 16,5mm (Hình 4). Do vậy, môi trường MPA* được lựa chọn làm môi trường lên men chính cho sinh tổng hợp CKN của chủng B. subtilis CVS3.3.
Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng nấm (CKN) chịu ảnh hưởng của môi trường và điều kiện nuôi cấy. Môi trường thích hợp là môi trường giúp chủng vừa có khả năng sinh trưởng tốt vừa sinh ra các sản phẩm mong muốn với hiệu suất tối ưu. Chủng B. subtilis CVS3.3 sinh trưởng và sinh CKN kém trên các môi trường MPA, LB*, NB và KB. Trên hai môi trường LB và MPA*, sau 3 ngày, chủng sinh trưởng tốt và đạt cao nhất trên LB (OD600nm s 6,2). Tuy nhiên hoạt tính kháng nấm thu được cao nhất trên môi trường MPA*, đường kính vòng kháng nấm (VKN) đạt 16,5mm (Hình 4). Do vậy, môi trường MPA* được lựa chọn làm môi trường lên men chính cho sinh tổng hợp CKN của chủng B. subtilis CVS3.3.
Bảng 2. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh CKN của chủng B. subtilis CVS3.3
Hình 4: Khả năng ức chế nấm bệnh Ceratocystis sp. của chủng B. subtilis CVS3.3 trên các môi trường
Để xác định nhiệt độ tối thích cho lên men sinh tổng hợp CKN, tiến hành nuôi cấy từ 250C - 450C với các điều kiện khác được giữ nguyên. Trong khoảng 30-37°C, chủng B. subtilis CVS3.3 phát triển và sinh tổng hợp CKN tốt hơn cả. Nhiệt độ thích hợp cho chủng phát triển không đồng thời là nhiệt độ tối thích hợp cho sinh CKN. Nhiệt độ phát triển thích hợp nhất của vi khuẩn B. subtilis CVS3.3 là 300C, OD600 đạt 6,3 sau 3 ngày (Hình 5).
Hình 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng
Hình 7: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng và sinh chất kháng nấm của chủng B. subtilis CVS3.3
 
Hình 8: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh CKN của chủng B. subtilis CVS3.3
KẾT LUẬN
Trong số những chủng mới phân lập được, chủng vi khuẩn CVS3.3 thể hiện khả năng đối kháng mạnh với nấm Ceratocystis sp. gây chết héo trên cây keo. Một số đặc điểm phân loại chính của chủng là: Trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử và sinh enzyme ngoại bào cao. Chủng CVS3.3 có khả năng sử dụng một số nguồn cacbon D-glucose, D-xylose, D-mannitol, D-fructose, saccarose, raffinose, sorbitol và trehalose, phát triển tốt trên hầu hết các môi trường nuôi cấy trong khoảng 15-550C, pH 3-10 và nồng độ muối là 0-6%. Đối chiếu với khóa phân loại của Bergey và trình tự 16S rDNA, chủng CVS3.3 có đặc điểm rất gần với loài Bacillus subtilis nên có thể định tên là Bacillus subtilis CVS3.3 và trình tự gen 16S rDNA của chủng được đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu Genbank với mã số truy cập MT039484. Môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng nấm của chủng đã được nghiên cứu lựa chọn. Chủng B. subtilis CVS3.3 sinh chất kháng nấm cao nhất trên môi trường MPA* có pH ban đầu 8,0 ở 370C.
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này được hỗ trợ kinh phí từ đề tài NVQG.003/19 thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 của Bộ Công Thương và trang thiết bị của Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đặng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Phạm Quang Thu, Nguyễn Minh Chí và Trần Thị Thanh Tâm, (2016), Bệnh chết héo Keo lá tràm, keo lai và Keo tai tượng tại Việt Nam, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 8: 134-140.
3. Heydari A. and Pessarakli M. (2010) A review on biological control of fungal plant pathogens using microbial antagonists.J. Biol. Sci., 10: 273-290.
4. Hong C.E, Jeong H., Jo S.H, Jeong J.C., Kwon S.Y., An D., Park J.M. (2016a). A leaf-inhabiting endophytic bacterium, Rhodococcus sp. KB6, enhances sweet potato resistance to black rot diseasecaused by Ceratocystis fimbriata. J. Microbiol. Biotechnol., 26:488-492. а. Jain P., Pundir R. K. (2011) Effect of fermentation medium, pH and temperature variation on antibacterial soil fungal metabolite production. J. Agri. Technol. 7(2):247-269.
5. Mezzomo R., Piveta G., Lazarotto M., Walker C. , Macie C.G., Muniz M.F., Araujo M.M. (2019) Biological Control of Ceratocystis fimbriata by Bacillus subtilis on Acacia mearnsii Seedlings, Floresta e Ambiente 2019; 26(4): e20160195, https://doi.org/10.1590/2179-8087.019516, ISSN 2179-8087 (online)
б. Moita C, Feio S.S, Lina Nunes L., Roseiro J.C. (2005) Optimisation of physical factors on the production of active metabolites by Bacillus subtilis 355 against wood surface contaminant fungi, Int. Biodeterior. Biodegradation, 55(4):261-269.
7. Omowumi O.A. and Samuel O.T. (2014) Antifungal activities of Bacillus subtilis isolated from some condiments and soil, Afr. J. Microbiol. Res. 8(18):1841-1849.
8. Rahman M.A., Begum M.F., Alam M.F. (2009), Screening of Trichoderma Isolates as a Biological Control Agent against Ceratocystis paradoxa Causing Pineapple Disease of Sugarcane, Mycobiol. 37(4) : 277-285.
9. Sajitha K.L., Dev S.A., Maria E.J. (2018) Biocontrol potential of Bacillus subtilis B1 against sapstain fungus in rubber wood, Europ. J. plant pathol., 150(1): 237-244.
10. Sambrook J. and Russell D.W. (2001) Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
11. William B. Whitman. (2009). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 3, Publisher Springer-Verlag, New York.
NGUYỄN THỊ HỒNG LIÊN1, NGUYỄN VĂN HIẾU1, TRẦN THỊ HƯƠNG1, NGUYỄN VŨ MAI LINH1, NGUYỄN TUẤN ANH2, PHẠM ĐỨC HUY2, PHAN THỊ HỒNG THẢO1
1 Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2 Viện Nghiên cứu Cây nguyên liệu giấy
Tổng số lượt truy cập :
  • 1
  • 0
  • 3
  • 8
  • 6
  • 0
  • 3
  • 8
lên đầu trang