Thứ sáu, 19/04/2024 | 21:01

Thứ sáu, 19/04/2024 | 21:01

Bài báo nổi bật

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất sữa chua mắc ca

Bài báo khoa học

Cập nhật 10:17 ngày 23/05/2020

Nghiên cứu tách chiết và hoạt tính sinh học của Adenosine, Cordycepin từ nấm Cordyceps militaris

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) Cordyceps militaris là một trong hơn 350 loài nấm thuộc chi Cordyceps, họ Ascomycetes sống kí sinh trên cơ thể côn trùng. Từ xa xưa "Đông trùng hạ thảo" đã được người Trung Quốc sử dụng rộng rãi như một loại thuốc bổ dân gian nhằm tăng cường sức khỏe, sức bền và sự dẻo dai. Cordyceps militaris có chứa những hợp chất quí với hàm lượng cao như cordycepin, adenosine, polysaccharide. Đây là những hợp chất có giá trị dược liệu và kinh tế. cordycepin dễ tương thích sinh học với cơ thể người nhờ có cấu trúc tương tự như nucleoside. Các nghiên cứu chỉ ra Cordycepin có hoạt tính sinh học như ức chế khả năng sinh tổng hợp purine, điều hòa quá trình sản xuất interleukin của tế bào lympho T, gây độc tế bào, kháng nấm và kháng virus.[1-3] Hoạt chất adenosine còn được biết đến với vai trò khởi động quá trình chết theo chương trình (apotosis) ở tế bào ưng thư gan, [4,5] hay có tác dụng đích đối với các thụ thể trong bảo vệ cơ thể chống lại bệnh viêm da.[6] Ngoài ra, adenosine còn có tác dụng chống co cơ và tác động tích cực tới bệnh trầm cảm trên chuột. [7]
Trong nghiên cứu này chúng tôi phân lập hoạt chất adenosine, cordycepin từ quả thể nấm Cordyceps militaris nuôi trồng nhân tạo và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng.
2. THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên liệu
Các hóa chất tinh khiết được mua từ hãng Sigma-Aldrich, Cordycepin và Adenosine chuẩn có độ tinh khiết dùng cho HPLC. Các dung môi chạy cột sử dụng dung môi công nghiệp đã làm khan và cất lại.
Quả thể nấm Cordyceps militaris(L.exFr.) Link. Do Viện Hóa học - Vật liệu, Viện Khoa học và Công nghệ quân sự nuôi cấy.
2.2. Phương pháp
2.2.1. Xác định cấu trúc, hàm lượng của các chất
Cấu trúc của các chất được minh chứng bằng các phương pháp phổ NMR và MS. Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR được đo trên máy BRUKER AVANCE - 500M ở các tần số lần lượt là 500MHz và 125MHz tại Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam sử dụng chất nội chuẩn là TMS. Độ chuyển dịch hóa học được tính bằng đơn vị ppm. Phổ khối lượng MS được đo trên máy Aglient 1200 Series LCMSD 6310 Ion Trap LC/MS tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hàm lượng chất chiết được đo trên máy HPLC Alliance Water 2695D, detector PDA ở 259 nm tại Học Viện Quân Y.
2.2.2. Phương pháp chiết xuất và tinh chế
Bột nấm quả thể Cordyceps militaris được tiến hành chiết với dung môi cồn-nước với tỷ lệ cồn-nước khảo sát lần lượt là 3-7 (Mẫu 1); 1-1(Mẫu 2); 4-1(Mẫu 3), tỉ lệ dung môi và nguyên liệu là 10 : 1 (mL/g) bằng phương pháp rung siêu âm với thiết lập: công suất 400W và tần số 50 kHz, các mẫu được chiết 3 lần mỗi lần 120 phút ở 600C. Dịch chiết được gộp lại của cả 3 lần, ly tâm bỏ bã, định mức và đo HPLC xác định hàm lượng của adenosine và cordycepin.
Cao chiết được phân tách trên các cột silica gel khác nhau, rửa giải bằng hệ dung môi chloroform : metanol (5:1).
2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm
Hoạt tính kháng viêm được thử nghiệm tại Viện Hóa sinh biển (VAST) thông qua xác định khả năng ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào RAW264.7, Cardamonin: được sử dụng làm chất đối chứng [8-10].
Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào
Hoạt tính gây độc tế bào được thử nghiệm tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (VAST) theo phương pháp Theo phương pháp của Skehan & cs. (1990) và Likhiwitayawuid & cs. (1993) trên bốn dòng ung thư: Hep-G2, LU-1, MCF-7 và Vero, ellipticine được sử dụng làm đối chứng dương.[11,12]
Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher & Vlietlinck (1991) và McKane & Kandel (1996).[13-15] Thử nghiệm được tiến hành tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (VAST).
Các chủng vi sinh vật dùng để kiểm định gồm Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli (ATCC 25922) và Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923), Vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis (ATCC 11774) và Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC 11632), Nấm sợi: Aspergillus niger (439) và Fusarium oxysporum (M42), Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754) và Saccharomyces cerevisiae (SH 20). 
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả tách chiết adenosine, cordycepin
Adenosine và cordycepin là hai dẫn xuất của adenine gắn với đường ribose, cordycepin (3'-deoxyadenosine) khác adenosine bởi thiếu 1 nhóm hydroxy ở vị trí 3' trên phân tử đường. Hai hoạt chất này có tính bazơ, phân cực, tan tốt trong methanol, ethanol, chloroform. Để dễ đưa vào áp dụng tinh chế ở qui công nghiệp tạo khối lượng sản phẩm lớn phục vụ chăm sóc sức khỏe, chúng tôi lưa chọn ethanol làm dung môi chiết. Sau khi chiết 3 lần với ethanol ở nhiệt độ 60oC, thời gian 120 phút, hàm lượng adenosine, cordycepin trong dịch chiết xác định bằng HPLC, kết quả thu được dưới bảng sau:
Bảng 1: Kết quả xác định hàm lượng adenosine, cordycepin
Từ bảng 1 cho thấy, khi chiết bằng hệ dung môi cồn-nước tỉ lệ 1:1 thu được hàm lượng adenosine, cordycepin với khối lượng 0,78 và 3,81mg/g cao nhất, tương đồng với nghiên cứu của Hsiu-Ju Wang và Nguyễn Tiến Thành, kết quả này cho thấy điều kiện chiết xuất trên là tối ưu. Điểm khác biệt, hàm lượng cordycepin trong công bố của Nguyễn Tiến Thành (2,06 mg/g) thấp hơn so với nghiên cứu của chúng tôi và thấp hơn nghiên cứu của Hsiu-Ju Wang (7,04 mg/g), có thể lý giải sự khác biệt này là do chất lượng quả thể nấm Cordyceps militaris.[16,17] Phương pháp chiết này có thể áp dụng sản xuất cao dược liệu.
3.2 Kết quả tinh chế adenosine, cordycepin
Dịch chiết 100g bột quả thể nấm Cordyceps militaris trong 50% cồn, định tính adenosine và cordycepin trong dịch chiết bằng TLC với chất chuẩn. Đem cất quay dưới điều kiện áp xuất giảm ở nhiệt độ 100oC thu được 31 g cao tổng. Hòa tan cao tổng trong 300 mL nước cất, chiết 3 x 100 mL chloroform, gộp dịch chiết làm khô bằng Na2SO4 khan, quay khô thu được 5,67 g cặn. Lần lượt cho qua cột Sephadex LH-20, Silica gel kích thước hạt 40 - 63 µM, hệ dung môi rửa giải chloroform : metanol (5:1), thu được 25 mg hoạt chất CMA và 264 mg hoạt chất CMC.
Chất sạch CMA, CMC được xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR; phổ khối lượng MS:
Hình 1: Công thức cấu tạo của adenosine và cordycepine
CMA: Dạng bột, màu trắng, Tnc: 234 - 236 oC. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm) δ 8,34 (1H, s, H-8); 8,13 (1H, s, H-2); 7,31 (2H, s, -NH2); 5,88 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-1'); 5,39 (2H, m, 2'-OH, 5'-OH); 5,15 (1H, d, J = 4,5 Hz, 3'-OH); 4,61 (1H, dd, J1 = 6 Hz, J2 = 6,5 Hz H-2'); 4,14 (1H, m, H-3'); 3,96 (1H, dd, J1 = 3,5 Hz, J2 = 3,5, H-4'); 3,67 (1H, m, Hb-5'); 3,56 (1H, m, Ha-5'). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) δ 156,12 (C-6); 152,32 (C-2); 149,03 (C-4); 139,85 (C-8); 119,32 (C-5); 87,87 (C-1'); 85,84 (C-4'); 73,39 (C-2'); 70,61 (C-3'); 61,63 (C-5'). ESI-MS [M+H]+: 267,1.
CMC: Dạng bột, màu trắng, Tnc: 224 - 226 oC. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm) δ 8,35 (1H, s, H-8); 8,14 (1H, s, H-2); 7,25 (2H, s, -NH2); 5,87 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-1'); 5,64 (1H, d, J = 4 Hz, 2'-OH); 5,14 (1H, t, 5'- OH); 4,58 (1H, m, H-2'); 4,35 (1H, m, H-4'); 3,69 (1H,m, Hb-5'); 3,52 (1H,m, Ha-5'); 2,26 (1H, m, Hb-3'); 1,93 (1H, m, Ha-3'). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) δ 156,01 (C-6); 152,40 (C-2); 148,84 (C-4); 139,06 (C-8); 119,07 (C-5); 90,78 (C-1'); 80,65 (C-4'); 74,56 (C-2'); 62,61 (C-5'); 34,07 (C-3'). ESI-MS [M+H]+: 251,2.
So sánh đặc điểm tín hiệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hoạt chất CMA, CMC chiết được từ nấm Cordyceps militaris với công bố dữ liệu phổ của hoạt chất adenosine và cordycepin trong công bố của tác giả Wenyi Kang và cộng sự,[18] cho thấy có độ tương đồng ở các vị trí tương ứng. Qua đây cho phép khảng định cấu trúc hợp chất CMA là adenosine, hợp chất CMC là cordycepin.
3.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học
3.3.1 Kết quả thử hoạt tính kháng viêm
Hợp chất adenosine, cordycepin được mang sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào RAW264.7, hợp chất adenosine không có khả năng ức chế sản sinh NO. Hợp chất cordycepin có hoạt tính ức chế sự sản sinh NO tốt ở cả hai nồng độ thử nghiệm 30 μM và 100 μM. Tuy nhiên ở nồng độ 100 μM, mẫu cordycepin gây độc cho tế bào RAW264.7. Giá trị IC50 hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) được xác định ở nồng độ 24,55 μM, kết quả thu được dưới bảng 2. Trong một nghiên cứu khác của tác giả Xiaoxia Zhou và cộng sự đã công bố cordycepin ở nồng độ 24 μg/ mL có tác dụng tích cực đến việc sản xuất interleukin-10.[3]
Bảng 2: Kết quả hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)
3.3.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào
Hoạt tính gây độc tế bào của hai hợp chất adenosine và cordycepin được thử nghiệm trên ba dòng tế bào ung thư người là Hep-G2, LU-1, MCF-7 và Vero, kết quả thu được ở bảng 3:
Bảng 3: Kết quả hoạt tính gây độc tế bào
Hoạt chất adenosine không gây độc cho cả bốn dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Trong nghiên cứu của D. Yang,[4] Adenosine được chứng minh chỉ có khả năng làm giảm mật độ tế bào ung thư Hep-G2 bằng cách kích hoạt con đường apptosis, nồng độ thử nghiệm lên tới 20 mM. Hợp chất cordycepin gây độc cho ba dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, ung thư vú MCF-7 và tế bào ung thư biểu mô thận khỉ Vero với giá trị IC50 lần lượt là 15,97; 5,83 và 17,19 mg/mL. Hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư vú của cordycepin là tốt nhất IC50 là 5,83 mg/mL.
3.3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy cả hai hoạt chất adenosine, cordycepin đều có khả năng ức chế nấm A. niger ở nồng độ IC50 100 mg/ mL. Hoạt chất cordycepin còn có khả năng kháng nấm S. cerevisiae và vi khuẩn S.aureus ở nồng độ IC50 lần lượt là 25 và 100mg/mL.
Bảng 4: Kết quả hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
4. KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tìm được điều kiện chiết adenosine, cordycepin tối ưu bằng hệ cồn-nước tỉ lệ 1:1. Đã tinh chế, xác định được cấu trúc hai hợp chất adenosine, cordycepin bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Hợp chất cordycepin có tác dụng gây độc đối với ba trên bốn dòng tế bào ung thư thử nghiệm, trong đó hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 là tốt nhất (IC50: 5,83 mg/mL). Ngoài ra cordycepin còn có hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxit trên tế bào RAW264,7 (IC50: 24,55 μM). Cả hai hợp chất adenosine, cordycepin có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn yếu.
Lời cảm ơn. Công trình được hoàn thành dưới sự tài trợ về kinh phí từ đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Công nghệ sinh học chế biến, Bộ Công thương, mã số ĐT.11.19/CNSHCB.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
  1. Sugar A. M., Mc Caffrey R. P., Antifungal activity of 3'-deoxyadenosine (cordycepin), Antimicrob Agents Ch, 1998, (42), 1424-1427.
  2. Richardson L. S., Ting R. C., Gallo R. C., Wu A. M., Effect of Cordycepin on the replication of type-C RNA tumor viruses, Int J Cancer, 1975, (15), 451–456.
  3. Zhou X, Meyer C. U., Schmidtke P., Zepp F. Effect of cordycepin on interleukin-10 production of human peripheral blood mononuclear cells, Eur J Pharmacol, 2002, (453), 309–317.
  4. D. Yang, T. Yaguchi, C.-R. Lim, Y. Ishizawa, T. Nakano, and T. Nishizaki, Tuning of apoptosis-mediator gene transcription in HepG2 human hepatoma cells through an adenosine signal, Cancer Letters, 2010, 291(2), 225–229.
  5. Y. F. Ma, J. Zhang, Q. Zhang et al., Adenosine induces apoptosis in human liver cancer cells through ROS production and mitochondrial dysfunction, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2014, 448 (1), 8–14.
  6. S. Gessi, S. Merighi, and P. A. Borea, Targeting adenosine receptors to prevent inflammatory skin diseases, Experimental Dermatology, 2014, 23(8), pp. 553–554.
  7. J. E. Coelho, P. Alves, P. M. Canas et al., Overexpression of adenosine A2A receptors in rats: effects on depression, locomotion, and anxiety, Frontiers in Psychiatry, 2014, 5, article 67.
  8. Nathan C., Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. Faseb j, 1992, 6(12): p. 3051-64.
  9. Dirsch, V.M., H. Stuppner, and A.M. Vollmar, The Griess assay: suitable for a bio-guided fractionation of anti-inflammatory plant extracts, Planta Med, 1998, 64(5): p. 423-426
  10. Hatziieremia, S., et al., The effects of cardamonin on lipopolysaccharide-induced inflammatory protein production and MAP kinase and NFκB signalling pathways in monocytes/macrophages. British Journal of Pharmacology, 2006, 149(2): p. 188-198.
  11. Likhitayawuid K., Angerhofer C.K. Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinoline alkaloids from Sephania evecta, Jounal of Natural Products, 1993, 56 (1) pp. 30-38.
  12. Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica D., Warren J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R., New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer agents. Eur J Cancer, 1991, 27, 1162–1168.
  13. Vlietinck A. J., Screening methods for detection and evaluation of biological activities of plant preparation, Bioassay Methods in Natural Product reseach and Drug development, (Kluwer acadamic publishers), USA, 1998.
  14. Vanden Bergher D. A., and Vlietinck, Screening methods for Antibacterial and Ativiral Agent from Higher Plants, Methods in Plant biochemistry. (Academic Press., )USA, V. 6, 1991.
  15. Mckane L. & Kandel J., Microbiology, (McGraw-Hill, INC), 1996.
  16. Nguyen Tien Thanh, Le Thi Lan Chi, Do Thi Thu Ha, La Thi Quynh Nhu, Tran Thi Phuong Thao, Truong Quoc Phong, Khuat Huu Thanh, Extraction of adenosine and cordycepin from spent solid medium of Cordyceps militaris culture, Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 221-228.
  17. Hsiu-Ju Wang, Meng-Chun Pan, Chao-Kai Chang, Shu-Wei Chang, Chang-Wei Hsieh, Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Cordycepin from Cordyceps militaris Using Orthogonal Experimental Design, Molecules, 2014, 19, 20808-20820.
  18. Juanjuan Zhanga, Wei Zhanga, Zhenhua Yin, Changqin Lib, Wenyi Kang, Procoagulant constituents from Cordyceps militaris. Food Science and Human Wellness, 2018, 282-286.
Abstract
In this research, we presented a method of extraction adenosine (CMA) and cordycepin (CMC) from fruit body Cordyceps militaris. Two isolated compounds were tested for anti-inflammatory, the result showed that compound CMC exhibited activity against nitric oxide (NO) on RAW264.7 cell line with IC50 values 24.5 µM. Their cytotoxicity was evaluated on four cancer cell lines Hep-G2, LU-1, MCF-7, Vero. The result showed that CMC compound exhibited the activity against the MCF-7, Hep-G2, Vero tested cell lines with IC50 values 5.83; 15.97 and 17.91 μg/ mL. Compounds CMC, CMA were tested for anti-microbial activity, the result showed that both exhibited activity against A. niger with MIC 100μg/mL, compound CMC also showed activity against S.cerevisiae and S. aureus with MIC value of 25 μg/mL, 100 μg/mL, respectively.
Keywords: Cordycepin, Adenosine, cytotoxicity, Cordyceps militaris, anti-inflammatory.
Trịnh Đắc Hoành1, Vũ Duy Nhàn1, Vũ Văn Dũng1, Nguyễn Thị Nhàn1,
Trần Thị Nguyệt1, Nguyễn Thị Ngoan1, Lê Đức Anh1*
Lưu Văn Chính2, Vũ Thị Hà2, Lê Mai Hương2, Trần Hồng Hà2, Nguyễn Đức Doan3
1Viện Hóa học - Vật liệu, Viện Khoa học và Công nghệ quân sự, số 17 Hoàng Sâm, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
2Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
3Khoa Công nghệ thực phẩm, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội.
(Bài đăng trên Tạp chí Hóa học tháng 12/2019, tập 57 số 6E)  

Tag:

Các tin khác

công nghệ sinh học

Bản quyền thuộc Ban Điều hành Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020

Tổng số lượt truy cập :
  • 1
  • 0
  • 6
  • 0
  • 5
  • 3
  • 1
  • 2
lên đầu trang