Thứ bảy, 11/07/2020 | 15:35

Thứ bảy, 11/07/2020 | 15:35
Cập nhật 03:44 ngày 18/03/2020

Kết quả xây dựng phương pháp phân tích histamine bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao để sử dụng trong nghiên cứu phân giải histamine trong nước mắm bằng vi khuẩn

I. ĐẶT VẤN ĐÊ
Nước mắm là một gia vị quan trọng của người Việt Nam. Sản phẩm lên men từ cá này cũng rất phổ biến ở một số quốc gia Đông Nam Á và ngày càng được chấp nhận sử dụng trên toàn thế giới. Nước mắm được coi là một nguồn cung cấp protein, các amino acid và khoáng chất [11]. Theo phương pháp truyền thống, ở nước ta nước mắm được sản xuất từ các loài cá biến nhỏ trộn với muối với tỷ lệ khoảng 3:1 và đế lên men trong một thời gian dài, từ 9-12 tháng hoặc lâu hơn. Theo Cục Chế biến nông lâm thủy sản năm 2014, sản lượng nước mắm của Việt Nam đạt tới hơn 215 triệu lít /năm với trên 2.800 cơ sở sản xuất [18].
Mặc dù, nước mắm chứa nhiều chất dinh dưỡng và có hương vị đặc trưng, sản phẩm này cũng có chứa một lượng amine sinh học, đặc biệt là histamine. Các hợp chất này có thế là một mối nguy đối với sức khỏe của người tiêu dùng [14,15]. Histamine là chất gây ngộ độc thực phẩm và gây dị ứng. Việc tiêu thụ histamine với liều lượng quá mức sẽ gây ra các triệu chứng bất lợi như sổ mũi, hen suyễn (do co thắt phế quản), nổi mề đay, phát ban, ngứa, phù (mí mắt, môi sưng húp), làm viêm, đỏ kết mạc mắt, gây sự tiết quá độ dịch vị ở dạ dày, tiêu chảy, gây giãn mạch, hạ huyết áp, và co thắt tim... [8]. Histamine được hình thành trong nước mắm do tác động loại bỏ nhóm carboxyl ra khỏi histidine, một amino axit phổ biến trong cá biển, bởi enzyme decarboxylase của vi sinh vật [7]. Brillantes và cs (2002) đã chứng minh hàm lượng histamine cao trong nước mắm là do sự kết hợp giữa histamine có trong nguyên liệu cá và histamine được hình thành trong quá trình lên men [3]. Enzyme histidine decarboxylase không chỉ được hình thành trong nguyên liệu trước giai đoạn lên men mà được tiếp tục được sinh ra trong thời gian chượp mắm [3].
Theo tiêu chuẩn về nước mắm do ủy ban Codex Việt Nam và Thái Lan đồng chủ trì biên soạn, hàm lượng histamine trong các nước mắm không được vượt quá mức 400 mg/kg [5]. Hoa Kỳ và Canada đua ra các ngưỡng tối đa lần lượt là 500 ppm và 200 ppm cho sản phẩm này [4, 6]. Theo Hiệp hội Khoa học và công nghệ Việt Nam (2013), một số sản phẩm nước mắm của Việt Nam có chứa histamine với hàm lượng từ 700 đến 3000 mg/kg [19]. Trong nước mắm Malaysia, hàm lượng histamine cao nhất được báo cáo là 1220 mg/kg [21]. Theo Brillantes và Samosorn (2001), histamine trong nước mắm cá cơm của Hàn Quốc lên tới 1380 mg/kg và trong nước mắm Thái Lan là 430 mg/kg [2].
Histamine rất bền với nhiệt độ đó đế loại bỏ hợp chất này ra khỏi thực phẩm là việc hết sức khó khăn, ngay cả xử lý nhiệt mạnh mẽ cũng không mang lại hiệu quả [12]. Cho đến nay, rất nhiều hướng nghiên cứu đã được tiến hành nhằm làm giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm như sử dụng phương pháp chiếu xạ, áp dụng áp suất thủy tĩnh cao, thay đổi thành phần khí quyển bao gói hay sử dụng các chủng khởi động. Theo Gardini và cộng sự việc sử dụng các chủng vi khuẩn làm chủng khởi động bổ sung trong quá trình lên men có thể là phương pháp hữu hiệu nhằm hạn chế sự hình thành histamine trong thực phẩm [7]. Trong đó, không thế không kế đến việc sử dụng các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine thông qua quá trình oxy hóa tách nhóm amine xúc tác bởi enzyme histamine oxidase hoặc histamine dehydrogenase. Histamine oxidase được tìm thấy trong Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus polymyxa, Arthrobacter crystallopoietes, và Brevibacterium linens [9,10,20,21,22]. Một vài chủng vi khuẩn sinh enzyme histamine dehydrogenase bao gồm Rhizobium sp. Nocardioides simplex, và Natrinema gari [16].
Nhiều phương pháp phân tích histamine như phương pháp huỳnh quang, phương pháp sắc ký khí, phương pháp sắc kỷ lỏng được đưa ra nhằm phân tích hàm lượng histamine có trong thủy sản [1,17]. Tuy nhiên, ở nước ta có rất ít công bố về phương pháp phân tích hàm lượng histamine có trong nước mắm cũng như trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn định hướng phân giải histamine. Mục đích của nghiên cứu này là nhằm xây dựng được phương pháp cụ thế đế xác định hàm lượng histamine trong nước mắm, cùng với đó là phương pháp xác định hàm lượng histamine có trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật nhằm ứng dụng vào việc nghiên cứu làm giảm hàm lượng histamine có trong nước mắm.
II. THỰC NGHIỆM
1.1. Thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao model LC Infinity 1260 (Agilent, Mỹ) bao gồm bơm cao áp 4 kênh, bộ loại khí cho dung môi (degasser), bộ bơm mẫu tự động, buồng điều nhiệt cho cột tách, detector huỳnh quang được dùng đế phân tích histamine. Cột tách sắc ký pha đảo Agilent Eclipse XBD - C18 (Agilent, Mỹ) dùng đế tách các hợp chất của histamine sau khi đã dẫn xuất hóa. Pha động (A) là dung dịch CH3COONH4 20mM (pH=5), pha động (B) là dung dịch acetonitrile (pH=3) được lọc qua màng lọc 0.45pm và lọc khí hòa tan bằng bế siêu âm. Tốc độ pha động được cố đinh 1ml/phút trong suốt quá trình tách sắc ký. Nhiệt độ cột tách được cài đặt tại 40°C, histamine được tách với chế độ đắng dòng với tỉ lệ hai kênh pha động rửa giải A : B là 80:20. Histamine được phát hiện bằng detector huỳnh quang tại bước sóng kích thích λex=230nm và bước sóng phát xạ λem=450nrn. Tổng thời gian tách sắc ký cho một mẫu là 30 phút. Nhiệt độ khay đựng mẫu được duy trì tại 4°c. cột chiết pha rắn pha đảo Bond elute C18 (200 mg, 6 mL, Agilent, Mỹ) được sử dụng đế làm sạch nền mẫu, đặc biệt nền mẫu có hàm lượng muối cao và các chất ảnh hưởng khác có trong nền mẫu nước mắm.
1.2. Hóa chất
Histamine (độ tinh khiết > 98%), o-phthalaldehyde (OPA), 2-mercaptoethanol (MCE) được sản xuất bởi công ty hóa chất Sigma (St Louis, MO, USA). Acetonitrile (ACN), methanol, sodium tetraborate (Na2B4O7.7H2O), acid formic (HCOOH), amonium acetate (CH3COONH4), ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA) và một số hóa chất khác có xuất xứ từ Đức. Một số hóa chất môi trường nuôi cấy vi sinh vật gồm NaCI, MgSO4.7H2O, cao nấm men, pepton, cao thịt, acid casamino, sodium glutamate,.4H2O, MnCI2.4H2O, KCI, trisodium citrate có xuất xứ từ Trung Quốc. Dung dịch o-phthalaldehyde (OPA) gồm: 2mg/ml o-phthalaldehyde (OPA), lOpl MCE, 0,5mg EDTA, 200mg Na2B407.7H20,200pl methanol được hòa tan và định mức lên 10ml bằng NaOH IM, pH=10 là tác nhân dẫn xuất đế phát hiện histamine có trong mẫu bằng detector huỳnh quang.
1.3. Xử lí mẫu phân tích
Mẫu nước mắm được axit hóa mẫu bằng formic acid theo tỉ lệ mẫu : nước : HCOOH đặc = 0,2mL : l,79mL : 10µL được lắc đều và siêu âm trong 10 phút. Mẫu nước mắm được làm sạch bằng đưa mẫu đã acid hóa qua cột chiết pha đảo C18 đã được hoặt hóa bằng 5 mL methanol, 5 mL nước deion và cuối củng là 5 mL formic acid pH 3. Bỏ khoảng 0.5 mL dung dịch mẫu đầu tiên đi qua cột chiết pha rắn, 1 mL dung dịch mẫu tiếp theo được hứng vào vial đựng mẫu cho bộ bơm mẫu tự động. Mẫu phân tích sau đó được chuyển vào bộ bơm mẫu tự động và dẫn xuất hóa bằng dung dịch OPA và bơm mẫu vào hệ thống HPLC-FI ngay sau khi quá trình dẫn xuất hóa kết thúc (online- In needle derivatization). Một cách tóm tắt, các bước dẫn xuất hóa xảy ra theo thứ tự sau: một thế tích chính xác dung dịch mẫu hoặc chất chuẩn được điều chỉnh pH bằng dung dịch đệm natritetraborat sau đó được dẫn xuất hóa bằng dung dịch OPA. Phản ứng dẫn xuất hóa được kết thúc bằng cách điều chỉnh pH của hỗn hợp phản ứng sử dụng dung dịch HCOOH 0,05%. Sau đó hỗn hợp phản ứng được bơm vào hệ thống HPLC-FI. Toàn bộ quá trình dẫn xuất hóa và bơm mẫu được tiến hành tự động. Các thông số như thể tích mẫu, tỉ lệ chất dẫn xuất hóa / chất phân tích, thời gian dẫn xuất hóa, thời gian trộn... được điều khiển thông qua phần mềm Chemstation (Agilent, Mỹ). Diện tích píc của sản phẩm dẫn xuất hóa được sử dụng đế định lượng histamine trong mẫu bằng phương pháp đường chuẩn.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ưu các điều kiện dẫn xuất và tách sắc ký
Đế xác định điều kiện sắc ký tối ưu nhằm xác định histamine, các thí nghiệm được tiến hành gồm thay đổi dung môi pha động và thay đổl tỉ lệ rửa giải của dung môi pha động theo các tỉ lệ khác nhau. Thông qua các kết quả thu được, với dung môi (pha A) CH3COONH4 20mM (pH=5) và (pha B) acetonitrile (pH=3) với tỉ lệ 80:20, amino acid có trong nước mắm tách biệt tốt nhất so với các phương pháp khác, nhiệt độ của cột phân tích là 40°C tách tốt hơn so với 35°c với tốc độ dòng 1 ml/phút. Các amine đặc biệt là histamine được xác định bằng việc so sánh thời gian lưu của chất có trong mẫu và trong chất chuẩn.
Định lượng histamine có trong mẫu thông qua đường chuẩn được xây dựng khi bơm chất chuẩn histamine ở các nồng độ khác nhau vào HPLC. Phương trình hồi quy tuyến tính của histamine được xác định là y = 2195,1 * X - 46,273 với hệ số tương quan R2 = 0,9989. Độ lặp lại của phương pháp được thực hiện bằng cách lặp lạl 6 lần bơm của củng một mẫu, bởi cùng một người thực hiện, trong cùng một ngày, với cùng một điều kiện phân tích. Kết quả thu được ở Bảng 1.
Độ lệch chuẩn tương đối của phương pháp là 2,73% thỏa mãn yêu cầu đế phân tích hàm lượng histamine có trong mẫu, giới hạn định lượng LOQ là 18,82 mg/L, giới hạn phát hiện LOD là 4,75 mg/L. Thông qua kết quả thu được phương pháp này có thế áp dụng đế phân tích định lương hàm lượng histamine.
Các amine sinh học và các amino acid cũng như histamine không có tính huỳnh quang, vì vậy khi phân tích trên HPLC với đầu dò huỳnh quang cần được dẫn xuất hóa với OPA. Khảo sát hàm lượng OPA trong dung dịch dẫn xuất ở lmg/ml, 2mg/ml và 4mg/ml, và thế tích của dung dịch dẫn xuất khi phản ứng với mẫu ở 4pl, 6pl, 8pl, và lOpl do dẫn xuất OPA không thế hiện hàm lượng OPA còn dư hay phản ứng hết khi phản ứng với các amine có mặt trong mẫu điều này sẽ ành hưởng đến quá trình phân tích và định lượng của chất cần phân tích. Kết quà thí nghiệm cho thấy, với hàm lượng của OPA là 2mg/mL và thể tích của dung dịch dẫn xuất là 6pL định lượng hàm lượng histamine đạt tốt nhất.
3.2. Hiệu suất thu hồi
Để chiết được histamine có trong mẫu nước mắm, các thí nghiệm được tiến hành gồm: methanol 75%, cột trao đổi anion, phương pháp kết tủa protein có trong mẫu, phương pháp loại muối, tricholoroacetic acid (TCA) và phương pháp sử dụng cột chiết pha đào C18. với phương pháp sử dụng cột chiết pha đào C18 kết quà phân tích định lượng histamine đạt tốt nhất, mẫu được acid hóa bằng HCOOH để đưa xuống pH 3, sau đó đưa qua cột đã được hoạt hóa. Hiệu suất thu hồi đạt đến 99.6%. Kết quả được thể hiện ở Bàng 2.
Với mẫu môi trường nuôi cấy vi khuẩn, khi xử lí mẫu với methanol 75% đạt hiệu suất thu hồi cao nhất. Các phương pháp khác như làm giàu histamine bằng cột trao đổi anion hay phương pháp kết tủa protein đều không định lượng hay phát hiện được sự có mặt của histamine có trong môi trường nuôi cấy mặc dù có bổ sung chuẩn histamine vào môi trường. Điều đó có thể giải thích được rằng, trong quá trình chiết mẫu, có thể thất thoát hoặc không tách được chất đó ra khỏi mẫu phân tích. Bàng 2 thể hiện hiệu suất thu hồi khi chiết mẫu môi trường sử dụng methanol 75%.
3.3. Đánh giá hàm lượng histamine trong dịch lên men sản xuất nước mắm
Với các nguyên liệu cá và thời gian ủ chượp khác nhau, lượng histamine sinh ra trong chượp mắm không giống nhau. Nhìn chung, hàm lượng histamine giảm dần từ tháng lên men thứ 6 đến tháng thứ 11 (Hình 3). Đối với chượp mắm làm từ cá nục (Decapterus), hàm lượng histamine giảm từ 530,04 mg/L xuống 304,27 mg/L, và giảm từ 794,89 mg/L xuống còn 537,56 mg/L với chượp mắm làm từ cá lâm (Sardinella). Kết quà này khá tương đồng với hàm lượng histamine trong chượp mắm của Thái Lan làm từ cá cơm (Stolephorus), với hàm lượng histamine ở tháng thứ 6 là khoáng 700 - 800 mg/L, tới tháng thứ 12 còn khoáng 620 - 680 mg/L [3]. Điều này có thể giài thích là do sự cạn kiệt của enzyme histidine decarboxylase trong giai đoạn sau của quá trình lên men nước mắm [3] hoặc có thể có sự có mặt của các vi sinh vật có khà năng phân giải histamine làm cho hàm lượng histamine giàm xuống.
3.4. Đánh giá khả năng phân giải histamine cùa các chủng vi khuẩn
Bốn chủng vi khuẩn phân lập từ chượp mắm gồm TT8.6, TT8.5, CT13.1 và CH3.3 được nuôi cấy trên môi trường thích hợp bổ sung 5% histamine nồng độ 5mM có vai trò như một cơ chất. Dịch nuôi cấy được lấy ngay tại thời điếm ban đầu và sau 7 ngày nuôi cấy đế phân tích hàm lượng histamine và xác định hiệu suất phân giải histamine của các chủng vi khuẩn. Dịch nuôi cấy được chiết bằng methanol 75% với tỉ lệ dịch: methanol (75%) = 100 pL : 900 pL, sau đó được siêu âm trong 10 phút và lọc qua màng lọc 0,45pm trước khi bơm lên hệ thống HPLC.
Kết quả thu được ở Bảng 3 cho thấy cả bốn chủng vi khuẩn đều có khả năng phân giải histamine với hiệu suất phân giải dao động từ 30 - 43%. Trong đó, chủng CT13.1 và CH3.3 đạt hiệu suất phân giải histamine cao nhất, 40-43%.
IV. KẾT LUẬN
Để phân tích hàm lượng histamine có trong dịch chượp mắm cũng như trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang được sử dụng. Histamine được dẫn xuất OPA và được phát hiện bằng detector huỳnh quang với bước sóng kích thích 230nm và bước sóng phát xạ 450nm. Mau nước mắm được làm sạch bằng cột chiết pha rắn trên nền pha đảo C18, trong khi đó mẫu môi trường nuôi cấy vi khuẩn định hướng phân giải his-tamine được chiết bằng methanol 75%. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng histamine trong chượp mắm thay đổi theo nguyên liệu sản xuất và thời gian lên men. Hiệu suất phân giải histamine của các chủng vi khuẩn đạt cao nhất là 43%, phù hợp đế ứng dụng bổ sung trong quá trình lên men nước mắm nhằm giảm hàm lượng hista-mine trong sản phẩm này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. AOAC 957.07, Determination of histamine in fishery product by HPLC.
2. Brillantes, s, Samosom, w. (2001). Determination of histamine in fish sauce from Thailand using a solid phase extraction and high-performance liquid chromatography. Hsherise Science, 67, 1163-1168.
3. Brillantes, s., Paknoi, s., Totakien, A (2002). Histamine formation in fish sauce production. Journal of Food Science, Vol. 7, Nr. 6,2090-2094.
4. CFIA-Canadian Food Inspection Agency (2003). fish Inspection Act. Ottawa, Canada: Dept of Justice.
5. FAO (2011). Codex Stan 302-2011. standard for fish sauce.
6. FDA (2011). US Department of Health and Human Services Food and Drug Administrahttp://www.fda.gov (February 2,2016).
7. Gardini, F., Ozogul, Y. Suzzi, G., Tabanelli, G., and Ozogul. F. (2016). Technological factors affecting biogenic amine content in food: A review. Frontiers in microbiology, volume 7. Article 1218
Kõse, s. (2010). Evaluation of seafood safety health hazards for traditional fish products: Preventive measuresand monitoring issues.Turkish J. fish. AquaticSci., 10:139-160.
8. Lee, Y. c, Lin, c. s. Liu, F. L, Huang, T. c, Tsai. Y. H. (2016). Reduction of histamine and biogenic amines during salted fish fermentation by Bacillus polymyxa as a starter culture. Journal offoodand drug administration, 157-163.
9. Lee, Y. c., Lin, c. s., Uu, F. L, Huang, T. c. (2015). Degradation of histamine by Bacillus polymyxa isolated from salted fish products. Journal of food and drug administration, 1021-9498.
10. Lopetcharat, K., Choi, Y. J., Jae, D, Park, w. and Daeschel, M. A (2001). fish sauce products and manufacturing:Aieview. Food Reviewslntemational,17:1,65-88.
11. Luten, J. B., Bouquet, w., Seuren, A. J., Burgraaf, M. M., Riekwel-Booy, G., Durand, R, Etienne, M., Gouyou, J. R, Landrein, A, Ritchie, A., Lederq, M. R. (1992). Biogenic amines in fishery products: standardization methods within EC. In: Huss, H.H. (ed.): Quality Assurance in the fish industry. Elsevier Science Publishers, Amsterdam. 427-439.
12. Martuscelli M., ứudele M. A, Gardini F, Suzzi G. Biogenic amine formation and oxidation by Staphylococcus xylosus strains from artisanal fermented sausages. Lett Appl. Microbiol. 31,228-232,2000.
13. Naila, A, Flint S', Fletcher, G., Bremer, R, and Meerdink, G. (2010). Control of biogenic amines in food-existing and emerging approaches. J Food Sd. 75,139-150.
14. Shalaby, A R. (1996). Significance of biogenic amines to food safety and human health. Food Research International 29:675-690.
15. Tapingkaẹ, w„ Parkin, K. L.Tanasupawat S', Kruenate, J. (2010). Whole cell immobilisation of Natrinema gari BCC 24369 for histamine degradation. Food Chemistry, 120,842 - 849.
16. TCVN 8352:2010, Thủy sản và các sản phám thủy sản-Xác định hàm lượng histamine- Phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao.
17. VASEP-Vietnam Assodation of Seafood Exporter and Producers, Annual report 2014.
18.Vietnam Union of Sdence and Technology Associations (2013). http://www.vusta.vn/vi/news/Lien-hiep-hoi-1733/Binh-Thuan-Muc-gioi-han-ham-luong- histamine-trong-nuoc-mam-47844.html
19. Zaman, M. z., Bakar, F. A, Selamat, J., Bakar, J., Ang, s. s., and Chong, c Y. (2014) Degradation of histamine by the halotolerant Staphylococcus camosus FS19 isolate obtained from fish sauce. Food Control. 40,58-63.
20. Zaman, M. z., Bakar, F. A., Selamat, J., and Bakar. J. (2010). Occurrence of biogenic amines degrading bacteria in fish sauce. Czech J. Food Sd. 28(5),440-449.
Zaman, M. z., Bakar, F. A, Jinap., s., and Bakar, J. (2011). Novel starter cultures to inhibit biogenic amines accumulation during fish sauce fermentation. International Journal of Food Microbiology. 145,84-91.
TRẦN THỊ THU HẰNG1*, NGUYỄN HOÀNG ANH1, NGUYỄN THỊ TỈNH1, BÙI THỊ THU HIỀN2, CHU ĐỈNH BÍNH3
1Khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
2Viện Nghiên cứu Hải sản
3Viện Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
(Bài đăng trên Bản tin  Khoa học và Công nghệ Công Thương, số 38/2019)

Bài cùng tác giả

Bài khác

Tổng số lượt truy cập :
  • 1
  • 3
  • 5
  • 6
  • 3
  • 9
  • 6
lên đầu trang