α-L-rhamnosidase là một enzyme được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm như khử đắng nước trái cây họ cam quýt, tăng cường hương thơm rượu vang. Enzyme α-L-rhamnosidase có khả năng thủy phân rutin ít tan trong nước thành isoquercetin có tính sinh khả dụng cao dễ hấp thu trong cơ thế nhằm ứng dụng trong công nghiệp hóa dược. Nghiên cứu này đã tối ưu các điều kiện lên men chìm sinh enzyme α-L-rhamnosidase từ Aspergillus niger ĐH51. Hoạt độ cao nhất của α-L-rhamnosidase đạt 5 u/ml ở nồng độ chất cảm ứng (0,5% Rutin), Rhamnose (1%), số ngày lên men (7), nhiệt độ (30°C) và pH (5,5). Dịch enzyme này được sử dụng đế chuyến hóa trực tiếp rutin thành isoquercetin cho hiệu suất chuyến hóa (80%), độ tinh khiết của isoquercetin (98%). sản phẩm isoquercetin được xác nhận bằng các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại như: HPLC, HR-ESI-MS và NMR.

α-L-rhamnosidase (EC 3.2.1.40) là enzyme phân cắt đặc hiệu đầu a-L-rhamnose từ một lượng lớn các sản phẩm tự nhiên như naringin, rutin, hesperldln và nhiều glycoside tự nhiên khác có chứa đầu a-L-rhamnose. α-L-rhamnosidase được ứng dụng trong quá trình khử đắng các loại nước ép trái cây họ cam quýt, tăng cường mùi hương rượu và khử rhamnose của nhiều glycoside tự nhiên có chứa a-L-rhamnose tạo các sản phẩm hữu ích dùng trong dược phẩm như isoquercetin (từ nguồn rutin), prunin (từ nguồn naringin)... Enzyme xuất hiện phổ biến trong tự nhiên: ở các mô động vật, thực vật, nấm men, nấm sợi và vi khuẩn. Tuy có nhiều công bố và sáng chế về α-L-rhamnosidase nhưng hiện nay chỉ có 2 chế phẩm thương mại của a-L-rhamnosidases là narlnglnase và hesperldlnase đều từ nấm sợi. Hesperldlnase từ loài Aspergillus niger và Penicillium [4] và naringinase từ Penicillium decumbens [8]. Một số loài nấm được ứng dụng sinh tổng hợp a-L-rhamnosidases đã công bố là Rhizopus nigricans, Stagonospora avenae, Aspergillus flavus, Mucor racemosus, Fusarium sambucinum, Aspergillus kawachii, Penicillium aureatiogriseum, Tricho- derma longibrachiatum, Fusarium solani [9]...

Yadav và đồng tác giả (2017) nghiên cứu sản xuất α-L-rhamnosidase từ Aspergillus flavus khi lên men chìm, tối ưu hóa bằng phương pháp Taguchi DOE. Kết quả sau tối ưu cho hoạt tính enzyme α-L-rhamnosidase đạt 3,88 u/ml [10]. Chủng A. niger lên men xốp trong môi trường có chứa 0,14 g bã mía, 1,25 g vỏ đậu tương và 3,05 g rơm thu được enzyme α-L-rhamnosidase có hoạt tính 1,92 u / mL; sau tối ưu hoạt tính tăng lên 3,02 U/mL trong môi trường độ ẩm trung bình là 75,5% và pH4[6]....

Quá trình chuyển hóa rutin tạo sản phẩm isoquercetin (quercetin-3-O- glucoside) nhờ enzyme α-L-rhamnosidase được trình bày trong sơ đồ 1. Isoquercetin ít có trong tự nhiên, tan tốt trong nước hơn rutin và quercetin, dễ hấp thụ ở ruột non hơn và có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn rutin như hoạt tính chống viêm, chống sơ vữa động mạch, chống oxi hóa,...[2]. Việc tối ưu sinh tổng hợp enzyme α-L-rhamnosidase từ chủng Aspergillus niger đế tạo sản phẩm isoquercetin được You và đồng tác giả nghiên cứu cho thấy tác dụng chống tăng sinh trên nhiều dòng tế bào ung thư bao gồm các tế bào ung thư ruột kết, vú, gan và phổi hơn quercetin và rutin [12]. Isoquercetin ứng dụng làm thuốc chống huyết khối, điều trị thiếu máu cục bộ cơ tim, thiếu oxy não và bệnh thiếu máu cục bộ do các đặc tính không bị oxy hóa, kháng viêm, chống đột biến, kháng virus và các tác động dược lý khác. Hơn nữa, isoquercetin là chất dầu quan trọng cho quá trình sinh tổng hợp EMIQ (enzymatically modified isoquercitrin), chất gần đây được phê duyệt làm phụ gla thực phẩm. Isoquercetin có nhiều tác dụng sinh học quý nhưhg ít có trong tự nhiên do đó giá thành cao. Gần đây, việc chuyến hóa rutin thành isoquercetin đã nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau: thủy phân acid, gia nhiệt, biến đổi vi sinh vật và phương pháp thủy phân sử dụng enzyme trong các điều kiện thích hợp [11]. Nghiên cứu này nhằm tối ưu các điều kiện lên men chìm, sinh tổng hợp enzyme a-l-rhamnosidases từ chủng Aspergillus niger ĐH51 và bước đầu sử dụng enzyme đế chuyến hóa rutin tạo sản phẩm isoquercetin.

Chủng Aspergillus niger ĐH51 phân lập được từ vùng đất trồng hòe lâu năm, hiện đang được lưu glữ và bảo quản trong bộ sưu tập của phân viện Công nghệ sinh học.

Hóa chất: p-nitrophenol 99% (Sigma), p-nitrophenyl-a-L-rhamnopy- ranoslde 98% (Slgma) ký hiệu là pNPR, naringin (Sigma), isoquercetin 98% (Sigma), rutin 95% (Hunan Huacheng Biotech. INC, Trung Quốc), rhamnose (Trung Quốc) và các hoá chất thông dụng khác.

Môi trường PDA (g/L): khoai tây 200, glucose 20, agar 18, pH 6,8; môi trường sinh tổng hợp enzyme, thành phần (g/L): KCI 0,5, KH2PO4 15, NH4CI 4, cao nấm men 5, 1 mL dung dịch Vishniac (EDTA 10 g, ZnSO4.7H2O 4,4 g, MnCI2.4H2O 1,01 g, CoCI2.6H2O 0,32 g, CUSO2.5H2O 0,315 g, (NH4)6MO7O4 0,22 g, CaCI2.2H201,47 g, FeSO4.7H2O 1,0 g, H20 cất 1L), 5 mL MgSO4 .7H2O 10% (w/v) và cơ chất., pH 6,0 (Abbate et al., 2012).

Các thiết bị cơ bản dùng nghiên cứu: UV-VIS Agilent 8453 (Mỹ), HPLC Agilent 1120 (Mỹ), đo phổ NMR Advance Brucker 500 MHz (Đức), đo phổ HR-ESI-MS Agilent 6530 Accurate- Mass Q-TOF LC/MS system (Mỹ), lắc ổn nhiệt Cetomat (Đức).

Chủng nấm mốc được tạo ra từ các nghiên cứu trước được bảo quản trong bộ sưu tập chủng của phân viện công nghệ sinh học được cấy ria trên môi trường dinh dưỡng PDA và nuôi ở 30oC trong thời gian từ 3-5 ngày đế thu bào tử.

Dịch huyền phù bào tử nấm trong dung dịch 0,1% tween 80 (đạt 107 bào tử/ml) đem tiếp giống vào bình tam giác 300 ml chứa 100 ml môl trường sinh tổng hợp enzyme (có bổ sung chất cảm ứng) đã khử trùng sao cho mật độ bào tử đạt 106 bào tử/ml. Bình tam giác được nuôi trong máy lắc ổn nhiệt ở 30°C, lắc 200 vòng/phút sau 5 ngày thu dịch lên men, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút thu dịch trong phía trên đế kiếm tra khả năng sinh tổng hợp enzyme a-L-rhamnosidase.

Hút 0,4 ml pNPR 3,5 mM vào ống nghiệm 5 ml thêm vào 0,5 ml đệm axetat 0,1 M, pH 5, thêm tiếp vào 0,1 ml dịch enzyme thô. ủ hỗn hợp phản ứng ở 50°C trong 10 phút. Sau đó dừng phản ứng bằng 3 ml NaOH 0,5 M, thu được 4 ml dung dịch, đem đo mật độ quang trên máy UV-VIS ở bước sóng 400 nm. Tất cả các phép đo được lặp lạl ba lần, lấy kết quả trung bình. Dựa vào đường chuẩn p-nitrophenolat tính được hoạt độ enzyme a-L- rhamnosidase trong dịch thô. Đối chứng là mẫu dịch enzyme thô đã bất hoạt ở 95°c trong 30 phút.

Một đơn vị hoạt độ của enzyme được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết đế xúc tác sự hình thành 1 µmol của sản phẩm (p-nitrophenol) trong một phút ở điều kiện thí nghiệm chuẩn.

Chuyến hóa rutin thành isoquercetin bằng enzyme α-L-rhamnosidase : dựa theo phương pháp của Masamitsu MoriWaki và đồng tác giả [5] đã được cải tiến.

Cho 2,5 lít dịch enzyme α-L-rhamnosidase thô, 1,25 lít dung dịch đệm axetat pH 4,7 (0,1 M), 1,25 lít sorbitol 70% vào thiết bị 5 lít Winpact. Bật máy khuấy với tốc độ 200 vòng/phút, đưa nhiệt độ của dung dịch lên 72°c và duy trì ở nhiệt độ này trong thời gian 1,5 giờ. Sau đó hạ nhiệt độ xuống 70°C, rồi bổ sung 95g rutin 95% vào hệ phản ứng, duy trì ở nhiệt độ này trong thời gian 24 giờ. Kết thúc phản ứng, làm lạnh hỗn hợp xuống 4°c, lọc rửa kết tủa bằng nước cất, sấy khô thu được sản phẩm isoquecetin có màu vàng.

Isoquercetin trong dịch chuyến hóa hoặc mẫu bột được tiến hành phân tích trên máy HPLC HPLC Agilent 1120 (Mỹ). Các thông số quan trọng của phương pháp như sau:

• Chạy gradient với hệ dung môi: Axetonitril / H3PO4 0,3% theo tỉ lệ sau:

• Cột Agilent Eclipse XDB - C18: 5 pm X 4,6 mm X 150 mm

• Tốc độ dòng : 1 ml / phút

• Nhiệt độ cột: 30°C

• Bước sóng: 370 nm

Qua các nghiên cứu khảo sát đã sử dụng môi trường sinh theo Abbate và đồng tác giả [1] đế tối ưu các điều kiện lên men chìm sinh tổng hợp α-L- rhamnosidases từ chủng Aspergillus niger ĐH51.

Chủng Aspergillus niger ĐH51 được nuôi trong môi trường theo Abbate và dồng tác giả có bổ sung các nguồn cơ chất cảm ứng khác nhau: 0,5% naringin, 0,5% rutin, 1% rhamnose, 1% bột hoa hòe, 1% bột vỏ quýt, nhiệt độ 30°C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, sau 5 ngày thu dịch lên men, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch sau ly tâm đế xác định hoạt độ enzyme α-L- rhamnosidase, kết quả thu được ở Hình 1,2.

Nghiên cứu trên các chất cảm ứng khác nhau đã thu được hoạt độ enzyme α-L-rhamnosidase khác nhau được xếp theo thứ tự từ cao xuống thấp Rutin 0,5% > Rhamnose 1% > Naringin 0,5% > bột Hoa hòe 1% > bột vỏ quýt 1% và với hoạt độ enzyme (U/ml) tương ứng  0,6 > 0,55 > 0,39 > 0,28 > 0,08. Chất cảm ứng  tốt nhất cho sinh tổng hợp enzym α-L-rhamnosidase được lựa chọn là Rutin 0,5%. Khảo sát khả năng sinh enzyme với nồng độ rutin khác nhau: 0,1% - 0,3% - 0,5% - 0,7%, kết quả cho thấy ở nồng độ rutin 0,5% cho hoạt độ enzyme cao nhất trong môi trường nuôi lắc sau 5 ngày (Hình 2). Kết quả tương đồng với công bố của Yadav và đồng tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của naringin, rutin, hesperidin và rhamnose đến việc sinh enzyme α-L-rhamnosidase của chủng Penicilium griseoroseum MTCC-9224, hoạt độ enzyme cao nhất ở môi trường bổ sung 0,5% rutin [1].

Chủng Aspergillus niger ĐH51 được nuôi trong môi trường theo Abbate và đồng tác giả (2012) có bổ sung 0,5% rutin ở các điều kiện pH: 4.0 - 5.0 - 5.5 - 6.0 - 7.0, nhiệt độ 30°C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, sau 5 ngày thu dịch lên men và xác định hoạt tính enzyme α-L- rhamnosidase.(Hình 3,4).

Khảo sát điều kiện môl trường pH và thời gian nuôi lắc đế xác định hoạt tính sinh enzyme α-L-rhamnosidase đối với chủng Aspergillus niger ĐH51 được trình bày trên Hình 3 và Hình 4. Kết quả cho thấy enzyme a-L- rhamnosidase có khả năng sinh enzyme trong môi trường acid từ pH 4 đến pH 5,5, trong đó hoạt độ enzyme cao nhất là 0,82 u/ml ở điều kiện pH 5,5. Kết quả tương đồng với công bố của Mendoza-Cal và đồng tác giả (2010) cho kẽt quả tối ưti các chủng A. foetidus, A. niger và A. niger HPD2 đều cho hoạt độ enzyme narlnglnase cao nhất (lần lượt là 2,58 u/ml, 2,06 u/ml và 1,68 u/ml) ở pH 5,4 [3]. Kết quả tối ưu các điều kiện lên men sản xuất narlnglnase từ chủng Aspergillus niger MTCC 1344 cho kết quả enzyme naringinase có hoạt độ cao trong các môi trường pH 4,5-6, cao nhất ở pH4,5 (5,4 u/ml) sau 7 ngày nuôi lắc, ở điều kiện môi trường pH dưới 4 hoạt độ enzyme thấp (dưới 1U/ml) [7].

Kết quả khảo sát về thời gian nuôi lắc chủng Aspergillus niger ĐH51 cho thấy hoạt độ enzyme α-L-rhamnosidase đạt cao nhất 2,6 u/ml sau 7 ngày nuôi, sang ngày thứ 8, thứ 9 hoạt độ enzyme có giảm nhẹ (Hình 4). Kết quả tương đồng với các công bố [7,11].

Chủng Aspergillus niger ĐH51 được nuôi trong môl trường dựa theo Abbate và đồng tác giả [1], chất cảm ứng  0,5% rutin, pH 5,5 và có bổ sung các nguồn carbon (1% đường mía, glucose, maltose, rhamnose), nguồn nitrogen (bột đậu tương, casein, peptone, urea, NaNO3), muối khoáng (MgSŨ4, CaClj), nhiệt độ 30°C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, sau 7 ngày thu dịch lên men đế kiếm tra hoạt tính enzyme α-L-rhamnosidase, kết quả thu được ở Hình 5.

Khảo sát các nguồn carbon được sử dụng gồm: đường mía, glucose, maltose, rhamnose ở nồng độ 1% đã chỉ ra với nguông Rhamnose 1% được bổ sung vào môi trường đã sinh tổng hợp enzyme α-L-rhamnosidase cao nhất với hoạt độ là 5 U/ml, cao gấp 2 lần so với đối chứng chỉ có 0,5% rutin (2,5 u/ml), một số nguồn carbon như đường mía, glucose cũng cho hoạt độ enzyme cao hơn đối chứng; khi bổ sung thêm các nguồn nitrogen (bột đậu tương, casein, peptone, urea, NaNO3), chỉ có casein làm tăng hoạt độ enzyme, còn lạl cho hoạt độ enzyme thấp hơn đối chứng . Khi bổ sung thêm 10 mM MgSO4 cho kết quả thấp hơn so với đối chứng (có thế do trong môi trường theo Abbate và đồng tác giả (2012) đã có Mg++ rồi nên không cần bổ sung thêm), trong khi bổ sung thêm 10 mM CaCI2 (2,8 u/ml) cao hơn đối chứng. Tuy vậy khi lên men chìm trong môi trường có bổ sung 0,5% rutin, 1% rhamnose, 1% casein, 10 mM CaCI2 lại cho kết quả hoạt độ enzyme chỉ đạt khoảng 3,8 u/ml, thấp hơn ở môi trường chỉ bổ sung 0,5% rutin, 1% rhamnose (5 u/ml). Theo Puri và đồng tác giả (2005), khi tối ưu các nguồn carbon cho hoạt độ enzyme narlnglnase cao nhất khi bổ sung 1% mật đường hoặc 1% rhamnose đều có hoạt độ 4,6 u/ml cao gấp 2,3 lần so với đối chứng (kết quả tương đồng với nghiên cứu này), khi bổ sung các nguồn nitro¬gen: bổ sung 1% peptone cho hoạt độ enzyme cao gấp 1,4 lần so với đối chứng, khi bổ sung các ion lOmM Ca++ và Mg++ cho hoạt độ enzyme cao hơn 1,3 lần so với đối chứng [7].

Như vậy môi trường tối ưu nuôi chủng Aspergillus niger ĐH51 có bổ sung 0,5% Rutin và 1% rhamnose đế sinh tổng hợp enzyme α-L-rhamnosi- dase với hoạt độ đạt 5 u/ml, cao hơn so với các công bố của Yadav và đồng tác giả (2017) sau tối ưu sản xuất α-L-rhamnosidase từ Aspergillus flavus khi lên men chìm, cho hoạt tính enzyme α-L-rhamnosidase đạt 3,88 u/ml [10], Petri và đồng tác giả công bố kết quả lên men xốp với chủng A. niger trong môi trường có chứa 0,1 g bã mía, 1,25g vỏ đậu tương và 3,05g rơm thu được enzyme α-L-rhamnosi- dase có hoạt tính 1,92 U/mL; sau tối ưu hoạt tính tăng lên 3,02 U/mL trong môi trường độ ẩm trung bình là 75,5% và pH 4 [6]... Kết quả này có thế được xem là kết quả công bố ở việt Nam đầu tiên và ứng  dụng khả năng chuyến hóa rutin thành Isoquercetin bằng enzyme α-L-rhamnosidase thô từ chủng Aspergillus niger ĐH51

Sử dụng dịch enzyme a-L- rhamnosidase thô (hoạt độ 5 u/ml) đế chuyến hóa rutin thành isoquercetin với hiệu suất chuyến hóa cao đạt 80%, độ tinh khiết của isoquercetin đạt 98% dựa vào phân tích HPLC. Cấu trúc của isoquercetin được xác nhận bằng các phương pháp hóa lý hiện đại: 1H-NMR, 13C-NMR, DEP, H-HCOSY, HSQC, HMBC, HR-ESI-MS. Các thông tin về sắc ký đồ và dữ liệu phổ của Isoquercetin được trình bày ở hình 7(a,b).

​​

1H NMR (DMSO-dg, 500 MHz), ᵟ(ppm): 12,63 (s, 1H, HO¬C-7); 7,584-7,57 (m, 2H, H-2', H-61); 6,84 (dd, J1 = 4,75 Hz, J2 = 4,25 Hz, 1H, H-51); 6,40 (d, J = 2 Hz, 1H, H-8); 6,20 (d, J = 2 Hz, 1H, H-6); 5,45 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-l"); 5,264-4,24 (band, 4H, OH đường); 3,57 (d, J = 11,5 Hz, 1H, H-6"); 3,24 (m, 2H, H-2", H-3"); 3,09 (m, 2H, H-5", H-4").

13c NMR (DMSO-dg, 125 MHz), 0(ppm): 177,5 (04);

164,1 (C-7); 161,3 (C-5); 156,3 (C-9); 156,2 (C-2); 148,5 (C-41); 144,8 (C-3'); 133,4 (C-3); 121,6 (C-6');121,2 (C-l1); 116,2 (C-21); 115,2 (C-S1); 104 (C-10); 100,9 (C-l"); 98,7 (C-6); 93,5 (C-8); 77,6 (C-5n); 76,5 (C-3"); 74,1 (C-2"); 69,9 (C4"); 70(C-6"), 

HR-ESI-MS: tính toán cho công thức C21H2QO12: 464,0955, thực tế đo được: 464,0950.

Tối ưu được điều kiện, môi trường lên men chìm chủng Aspergilus niger ĐH51 đế sinh enzyme α-L-rhamnosidase thô đạt hoạt độ 5 u/ml với môi trường bổ sung 0,5% rutin, 1% rhamnose, pH 5,5, nuôi lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 30°C trong 7 ngày.

Lần đầu tiên sử dụng enzyme α-L-rhamnosidase thô (hoạt độ 5 u/ml) đế chuyến hóa rutin thành isoquercetin với hiệu suất đạt 80%, độ tinh khiết của isoquercetin đạt 98% theo phân tích HPLC.

1. Abbate ER, Palmeri A, Todaro RM, Blanco, Spagna G (2012) Production of a α-L-rhamnosidase from Aspergillus terreus Using Citrus Solid Waste as Inducer for Application in Juice Industry. Chemical engineering transactions 27:253-258.

2. Lee YS, Huh JY, Nam SH, Kim D, Lee SB (2013) Synthesis of quercetỉn-3-O- glucoside from rutin by Penicillium decumbens naringinase. J Food Sci 78(3): 411415

3. Mendoza-Cai A, Cuevas-Glory L, Lizama-Uc G, Elizabeth Ortiz-Vázquez E (2010) Naringinase production from filamentous fungi using grapefruit rind in solid state fermentation. African Journal of Microbiology Research 4(19): 1964-1969.

4. Monti D, Pisvejcova A, Kren V, Lama M, Riva s (2004) Generation of an a-L- rhamnosidase library and its application for the selective derhamnosylation of natural products. Biotechnol Bioeng 87(6): 763-771.

5. Mori WM (2008) Method for manufactoring a-glycosylisoquercetin intermediate productand by product thereof. Patent US20080187622A1.

6. Petri AC, Buzato JB, Celligoi MAPC, Borsato D (2014) Optimization of the Production of α-L-rhamnosidase by Aspergillus niger in Solid State Fermentation

Using Agro-Industrial Residues. British Microbiology Research Journal 4(11): 1198¬1210.

7. Puri M, Anirban BA, Banerjee uc (2005) Optimization of process parameters for the productionof naringinase by Aspergillus niger MTCC 1344. Process Biochemistry 40:195-201.

8. Romero c, Manjon A, Bastida J, Iborra JL (1985) A method for assaying the rhamnosidase activity of naringinase. Analytical Biochemistry 149(2): 566-571.

9. Yadav V, Yadav PK, Yadav s, Yadav KDS (2010) a -L-rhamnosidase: A review. Process Biochemistry 45:1226-1235.

10. Yadav p, Chauhan AK, Al-Sebaeai MA, Yadav s (2017a) Production of a-L- rhamnosidase from Aspergillus flavus: Optimization of Submerged Culture Conditions by Taguchi DOE Methodology. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences 6(3): 110-118.

11. Yadav s, Yadava s, Yadav KDS (2017b) α-L-rhamnosidase selective for rutin to ỉsoquercỉứỉn transformation from Penicillium griseoroseum MTCC-9224. Bioorga nic Chemistry 70:222-228.

12. You HJ, Ahn HJ, Ji GE (2010) Transformation of rutin to antiproliferative quercetin-3-gIucoside by Aspergillus niger. J Agric Food Chem 58(20): 10886-10892.