Axit Chlorogenic (CGA – Chlorogenic acid) là một hợp chất polyphenol, có các tính chất sinh học quý bao gồm: kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng ung thư, chống béo phì, hạ huyết áp và chống co giật [16]. Axit này có nhiều ở nhân cà phê xanh 4,1-11,3 g/100g chất khô  và một số loại rau quả khác (táo, artichoke, cà rốt, nho, khoai tây, trà, lá thuốc lá, cà chua, lê) [8].

Để thu được axit Chlorogenic từ hạt cà phê xanh cần các biện pháp (hóa chất, vật lý, sinh học) phá hủy lớp màng nhớt (chứa pectin) giải phóng CGA từ hạt. Trong số đó, sử dụng enzyme pectinase là một phương pháp thích hợp nhất do điều kiện phản ứng ôn hòa, không gây ô nhiễm môi trường… Pectinase hiện nay được thu nhận chủ yếu trên quy mô công nghiệp từ vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus. Với khả năng phát triển nhanh trên nhiều loại cơ chất khác nhau, đặc biệt là trên các phế liệu nông nghiệp giàu pectin, nấm mốc Aspergillus niger luôn thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Do đó, việc tuyển chọn chủng Aspergillus niger sinh pectinase cao để tách chiết axit chlorogenic là vấn đề cần thiết.

Chủng A. niger từ bộ sưu tập giống của bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện công nghệ sinh học, Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam. Nguồn vật liệu thực vật là quả cà phê xanh (Robusta) của huyện Di Linh, tỉnh Lâm Đồng.

Tuyển chọn chủng A. niger có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao: Nuôi cấy các chủng A. niger trên môi trường Czapeck- pectin ở 30oC trong 3 ngày, quan sát và xác định đường kính khuẩn lạc. Các chủng có đường kính khuẩn lạc >4,5 cm được nuôi cấy trên môi trường cám-trấu chứa pectin 10% với độ ẩm 50% trong 3 ngày ở 30oC. Thu dịch enzym thô, xác định hoạt độ enzyme và lựa chọn chủng có hoạt độ pectinase cao nhất.
Xác định hoạt độ Pectinase: Hoạt độ Pectinase được xác định với cơ chất pectin. Phản ứng enzyme được thực hiện với 180 µl dung dịch pectin 1% (w/v) và 20 µl dung dịch enzyme, ở 50oC trong 10 phút, bổ sung 1 ml dung dịch DNS và đun sôi trong 10 phút. Tiếp đến, li tâm hỗn dịch phản ứng ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng 575 nm. Dựa vào đồ thị đường chuẩn acid galacturonic với dung dịch DNS để xác định hoạt độ enzyme. Một đơn vị hoạt độ Pectinase là lượng enzyme cần thiết để xúc tác chuyển hóa pectin tạo thành 1 µmol acid galacturonic trong thời gian 1 phút ở những điều kiện hoạt động thích hợp của enzyme [11, 15].

Khảo sát đặc tính của pectinase:

Nhiệt độ tối ưu của enzyme được tiến hành theo phương pháp xác định hoạt độ pectinase ở các nhiệt độ 30-70oC. Để khảo sát độ bền nhiệt, enzyme được ủ trong dung dịch đệm citrate photphat 0,1M pH 5,0 ở các nhiệt độ khác nhau (trong khoảng từ 20-60oC). Sau những khoảng thời gian 1-5 giờ, lấy mẫu xác định hoạt độ pectinase còn lại.

Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme được xác định ở nhiệt độ tối ưu của enzyme với cơ chất được pha trong dung dịch đệm citrate photphat 0,1M có các giá trị pH khác nhau nằm trong khoảng từ pH 3,0-7,0. Để khảo sát độ bền pH, enzyme được pha loãng và ủ ở 40oC với dung dịch đệm trên có các giá trị pH khác nhau, sau những khoảng thời gian 1-5 giờ, lấy mẫu xác định hoạt độ pectinase còn lại (với cơ chất được pha trong dung dịch đệm pH 5,0).

Ảnh hưởng của ion đến hoạt tính enzyme được nghiên cứu bằng cách ủ dung dịch enzyme với các ion kim loại Ca2+, Na+, K+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Mg2+ (nồng độ cuối 10 mM) trong đệm cictrate photphat 0,1M (pH 5,0) ở 50oC trong 10 phút, sau đó xác định hoạt độ pectinase còn lại và so sánh với mẫu không bổ sung ion kim loại (đối chứng).

Tách chiết chlorogenic từ hạt cà phê xanh: theo phương pháp của Belay và cộng sự (2009) có thay đổi một số điều kiện nghiên cứu. Nghiền 3g hạt cà phê xanh (0,5-1 mm), bổ sung pectinase trong đệm pH 5,5 và ủ ở 400C trong 2 giờ, tốc độ khuấy 50 vòng/phút. Thu dịch lọc lần 1 (bằng giấy lọc Whatman No1), bổ sung 30ml nươc cất, ủ ở 600C trong 2 giờ và lọc thu dịch lọc 2. Các dịch lọc được chạy sắc ký bản mỏng và đo OD324nm để xác định hàm lượng CGA. Thí nghiệm đối chứng được thực hiện tương tự, thay enzyme bằng nước cất để thu dịch lọc [7].

Định tính CGA: bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) theo phương pháp của Mirna et al. (2013) với hệ dung môi n-butanol: axit acetic: nước tỷ lệ 6:2:2.

Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp. Các kết quả nghiên cứu là trung bình của 3 lần lặp lại, số liệu được xử lý bằng Excel.

Từ 42 chủng A. niger phân lập từ bột và vỏ cà phê, thanh long, cam, bưởi, chanh leo, bã táo… được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc Czapeck - pectin ở 30oC. Sau 3 ngày nuôi quan sát và xác định đường kính khuẩn lạc. Trong số 42 chủng A. niger từ bộ sưu tập giống, chỉ có 21 chủng phát triển trên môi trường chứa pectin 1% với đường kính khuẩn lạc >4,5 cm (bảng 1). Lựa chọn các chủng này cho bước sàng lọc tiếp theo.     

Bảng 1. Đường kính khuẩn lạc A. niger trên môi trường chứa pectin

Chủng tuyển chọn A. niger CF5 có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao hơn so với công bố của Huỳnh Ngọc Oanh et al. (2008) 30,1 U/g, nhưng thấp hơn so với chủng A. niger của Antier et al (1993), chủng A. niger IM6 của Akhter và cộng sự (2011), chủng A. niger IM09 của Islam và cộng sự (2013) [1, 2, 3, 10]. Các tác giả này đã tối ưu điều kiện lên men từ các chủng A. niger phân lập để thu được pectinase có hoạt độ lần lượt là 138 U/g, 144,42 U/g và 831 U/g. Do vậy, để thu được pectinase có hoạt độ cao hơn phục vụ cho việc tách chiết axit Chlorogenic từ hạt cà phê xanh cần nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy hoặc nghiên cứu cải tạo chủng tuyển chọn được.

Như vậy, từ 42 chủng A.niger từ bộ sưu tập giống đã tuyển chọn được chủng nấm mốc A. niger CF5 phân lập từ cà phê có khả năng sinh tổng hợp pectinase 64,12 U/g môi trường sau 3 ngày nuôi cấy.

pH ảnh hưởng rất rõ rệt đến phản ứng enzyme vì pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và độ bền của enzyme. Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính pectinase của A. niger CF5 qua đó xác định được pH tối ưu và độ bền của enzyme.

Kết quả hình 1(A) cho thấy enzyme pectinase từ chủng A.niger CF5 hoạt động trong vùng pH từ 4-5 và hoạt độ enzyme thu được cao nhất ở pH = 5. Ở pH này, hoạt tính của pectinase là tối đa và sự thay đổi pH cao hơn hoặc thấp hơn đều làm hạ thấp đáng kể độ hoạt động của enzyme. Một số tác giả khi nghiên cứu đặc tính của pectinase từ A. niger cũng tìm được dải pH thích hợp cho hoạt tính pectinase nằm trong khoảng từ 3,5-5,5 và pH tối ưu là 4,5-5,5 [3, 5, 6, 12] .

Khảo sát độ bền pH của hoạt tính pectinase bằng cách ủ enzyme ở 40oC trong dung dịch đệm pH từ 3-7, sau những khoảng thời gian khác nhau, lấy mẫu xác định hoạt độ pectinase còn lại (với cơ chất được pha trong dung dịch đệm pH = 5). Kết quả thu được thể hiện ở hình 1(B) cho thấy pectinase từ chủng A. niger bền trong vùng pH 4-5. Sau 5 giờ ủ ở 40oC trong đệm pH 4-5 hoạt độ enzyme vẫn còn giữ hơn 60% so với ban đầu [13]. Ở pH 3, 6, 7 hoạt độ enzyme không ổn định và giảm đáng kể sau 5 giờ.

Mỗi enzyme đều có một giá trị nhiệt độ tối ưu mà ở đó hoạt tính của nó được thể hiện mạnh nhất cũng như có vùng nhiệt độ mà ở đó hoạt tính enzyme ít bị ảnh hưởng nhất gọi là vùng bền nhiệt của enzyme. Với mục đích xác định được nhiệt độ tối ưu của pectinase từ A. niger CF5, dịch enzyme được giữ ổn nhiệt tại các nhiệt độ 30 – 70oC.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của pectinase từ chủng A. niger CF5 (hình 2A) cho thấy khi tăng nhiệt độ từ 30-40oC, hoạt độ enzyme tăng và đạt cực đại tại 40oC. Khi nhiệt độ lớn hơn 40oC, hoạt độ enzyme giảm rất nhanh. Như vậy, nhiệt độ tối ưu của pectinase từ A. niger CF5 là 40oC, cao hơn so với nhiệt độ tối ưu (35oC) của pectinase từ Bacillus sp. MFW7 [9], cũng giống như nhiệt độ tối ưu của pectinase từ A. niger sử dụng nguồn cacbon từ vỏ cam [11].

Độ bền nhiệt của enzyme được xác định bằng cách giữ enzyme ổn định tại các nhiệt độ 30-70oC ở pH 5,0 trong 5 giờ. Kết quả khảo sát (hình 2B) cho thấy pectinase từ cả chủng A.niger CF5 là enzyme không bền nhiệt. Khi nhiệt độ tăng hoạt độ của pectinase giảm dần và enzyme chỉ bền ở 20-40ºC. Khi nhiệt độ lớn hơn 50oC hoạt độ của enzyme giảm rất nhanh và sau 5 giờ thì hoạt độ enzyme còn rất thấp (10%). 

 Các ion Na+, K+, không ảnh hưởng nhiều đến hoạt độ của pectinase từ A. niger CF5 (hình 3), ion Cu2+ lại có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme (hoạt độ tương đối 30,95%). Hoạt độ pectinase giảm xuống chỉ còn 78,97% do tác động của Mn2+ và 55,77% do Mg2+. Mặt khác, Ca2+ lại có tác dụng làm tăng hoạt độ của pectinase lên đến 113,59% tương tự như pectinase từ Trichoderma reesei F418 ion Ca2+ làm tăng hoạt độ enzyme 114,2% và từ Bacillus subtilis C4.

Báo cáo của Banu và cộng sự (2010) cho rằng Mg2+, Ca2+ không làm ảnh hưởng nhiều đến hoạt động pectinase, làm ức chế sự hoạt động của pectinase từ chủng Penicillium chrysogenum [7].

Kết quả từ ảnh chạy sắc ký lớp mỏng (hình 4), ở băng ĐC – dịch lọc từ hạt cà phê xanh thủy phân bằng nước cất, không bổ sung enzyme pectinase cho thấy không xuất hiện băng tại vị trí chất chuẩn (đường chạy M). Trong khi đó, đường chạy dịch lọc 1 & 2 (D1 & D2) xuất hiện băng tại vị trí chất chuẩn ở CGA. Điều đó chứng tỏ enzyme pectinase đã phân cắt pectin ở vỏ hạt cà phê xanh giải phóng CGA ra dịch lọc. Thêm vào đó 2 băng CGA ở dịch lọc 1 & 2 cho thấy đã chiết tách được CGA từ hạt cà phê xanh.

Định lượng CGA tại bước sóng 324 nm và so với đường chuẩn CGA thu được kết quả cả 2 dịch lọc từ hạt cà phê xanh đều chứa CGA (bảng 3) với hàm lượng 3,59 mg/ml (dịch lọc 1) và 3,3 mg/ml (dịch lọc 2).

Bảng 3. Hàm lượng CGA từ dịch chiết cà phê xanh bằng pectinase

Như vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy đã bước đầu sử dụng pectinase từ chủng A. niger CF5 để tách chiết CGA của hạt cà phê xanh thu được 32,69 mg/g nguyên liệu. Kết quả thu được thấp hơn báo cáo của Ayelign và cộng sự (2013) hàm lượng CGA tách chiết từ hạt cà phê xanh thu được là 46,144 mg/g nguyên liệu [4]. Do đó, để tăng hiệu suất chiết CGA từ hạt cà phê xanh thì cần có những nghiên cứu tiếp theo về nồng độ enzyme, tỷ lệ rắn: lỏng, nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy và thời gian thủy phân thích hợp.

Từ 42 chủng A. niger đã chọn lọc được chủng A.niger CF5 phân lập từ cà phê có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao (64,12 U/g) thích hợp để thu nhận axit Chlorogenic từ hạt cà phê xanh. Pectinase từ chủng này có đặc tính bền ở pH 4 - 5; 20 - 40ºC và pH tối ưu 5; nhiệt độ tối ưu 40oC. Kết quả thử nghiệm sử dụng pectinase vào quá trình tách chiết axit Chlorogenic từ hạt cà phê xanh thu được CGA có hàm lượng 32,69 mg/g nguyên liệu.

1. Huỳnh Ngọc Oanh, Trần Ngọc Hùng (2008). Thu nhận enzyme pectinase từ Asp.niger - tinh sạch bằng phương pháp lọc gel & lọc màng. Science & Technology Development 11(08): 46 – 50.
2. Akhter N., Morshed M.A., Uddin A., Begum F., Sultan T., Azad K.A. (2011). Producrion of pectinase by Aspergillus niger cultured in solid state media. International Journal of Biosciences 1(1): 33 - 42.
3. Antier P., Minjares A., Roussos S., Raimbault M., Gustavo V.G. (1993). Pectinase-hyperproducing mutants of Aspergillus niger C28B25 for solid-state fermentation of coffee pulp. Enzyme and Microbial Technology 15(3): 254-260.
4. Ayelign A.,   Sabally K. (2013). Determination of Chlorogenic acids (CGA) in coffee beans using HPLC. American Journal of Research Communication, 1(2): 78-91.
5. Bai Z.H., Zhang H.X., Qi H.Y., Peng X.W., Li B.J. (2004). Pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance- Bioresource Technology 95(1): 49-52.
6. Banu A.R., Devi M.K., Gnanaprabhal G.R., Pradeep B.V., Palaniswamy M. (2010). Production and characterization of pectinase enzyme from Penicillium chrysogenum. Indian Journal of Science and Technology 3(4): 377 - 381.
7. Belay A. and Gholap A.V. (2009). Characterization and determination of chlorogenic acids (CGA) in coffee beans by UV-Vis spectroscopy. African Journal of Pure and Applied Chemistry, 3(11): 234 - 240.
8. Farah A., Monteiro M., Donangelo C.M., Lafay S. (2008). Chlorogenic acids from green coffee extract are highly bioavailable in humans. The Journal of Nutrition, 38(12): 2309-2315. doi: 10.3945/jn.108.095554.
9. Hannan A., Bajwa R., Latif Z. (2009). Status of Aspergillus niger strains for pectinases production potential. Pakistan Journal of Phytopathology 21(1): 77 - 82.
10. Islam S., Feroza B., Alam A.K.M.R., Begum S. (2013). Pectinase production by Aspergillus niger isolated from decomposed apple skin. Bangladesh J. Sci. Ind. Res. 48(1): 25-32.
11. Khatri B.P., Bhattarai T., Shrestha S., Maharjan J. (2015). Alkaline thermostable pectinase enzyme from Aspergillus niger strain MCAS2 isolated from Manaslu Conservation Area, Gorkha, Nepal. Springer Plus 4: 488.
12. Maciel M.H.C., Herculano P.N., Porto T.S., Teixeira M.F.S., Moreira K.A., Souza-Motta C.M. (2011). Production and partial characterization of pectinases from palm by Aspergillus niger URM4645. African Journal of Biotechnology 10(13): 2469 - 2475.
13. Maldonado M.C., Saad A.M.S. (1998). Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid state systems. Journal of Industrial Micro biology & Biotechnology, 34- 38.
14. Mirna L.S.Q., Erick M. L.M, Oscar G.R. (2013). Antibacterial activity and antifungal and anti‐mycotoxigenic activities against Aspergillus flavus and A. ochraceus of green coffee chlorogenic acids and dodecyl chlorogenates. Journal of Food Safety 33(3): 360-368.
15. Motwani D.R., Meshram V.G., Jambhulkar V.S. (2013). Partial characterization of pectinase produced by Aspergillus niger grown on wheat bran. International Journal of Scientific & Engineering Research 4(12): 345 – 365.
16. Santana-Gálvez J., Cisneros-Zevallos L, Jacobo-Velázquez D.A. (2017) Chlorogenic acid: recent advances on its dual role as a food additive and a nutraceutical against metabolic syndrome. Molecules, 22: 1-21.

Nguyễn Việt Phương - Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm
Trịnh Thị Thùy Linh, Hoàng Mạnh Đạt, Vũ Kim Dung - Trường Đại học Lâm nghiệp​