Như vậy có thể thấy các chủng vi khuẩn Bt giả định phân lập từ các chế phẩm vi sinh có đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm tế bào, phản ứng hoá sinh, khả năng sinh bào tử và tinh thể tương đồng với chủng vi khuẩn Bt chuẩn. Đây cũng là những đặc điểm khác biệt đặc trưng của vi khuẩn Bt với các loài vi khuẩn khác có cùng hoạt tính hóa sinh trong chi Bacillus (Baumann và cs., 1984; Claus & Berkley, 1986; Slepecky & Hemphill, 1992; Carlson & Kolstø, 1993; Hansen và cs., 1998). Do vậy có thể bước đầu khẳng định các chủng vi khuẩn phân lập giả định là chủng vi khuẩn Bt.
Để khẳng định ở mức độ phân tử các chủng vi khuẩn phân lập là các chủng vi khuẩn Bt, chúng tôi kiểm tra sự có mặt của một số gen đặc trưng cho vi khuẩn Bt gồm gen GroEL, GyrB, XRE và gen Cry2 bằng phương pháp PCR (Chelliah và cs., 2019).
Hình 7. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen XRE (kích thước đoạn băng đặc hiệu 246bp).
Kết quả phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu nhân bản các gen đặc trưng của vi khuẩn Bt cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập giả định đều mang các vạch băng có kích thước bằng kích thước xuất hiện ở chủng vi khuẩn Bt chuẩn. Như vậy, kết hợp kết quả phân tích đặc điểm hình thái, sinh hoá và phân tích sự có mặt của các gen đặc trưng của vi khuẩn Bt bằng phương pháp PCR có thể khẳng định các chủng vi khuẩn phân lập là các chủng vi khuẩn Bt.
Tài liệu tham khảo
1. TCVN 12105:2018 Phân bón vi sinh vật - lấy mẫu.
2. TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007 with amendment 1:2013) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.
3. TCCS 09: 2020/BVTV Thuốc bảo vệ thực vật - phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
4. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11133:2015 (ISO 22119:2011) về Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase real-time (pcr real-time) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi. Phản ứng chuỗi polymerase real-time (pcr real-time) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm.
5. TCVN 7682 (ISO 20838), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính.
6. ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General requirements and definitions (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi trùng hợp để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Yêu cầu chung và định nghĩa).
7. Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10781:2015 (ISO/TS 13136:2012), vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thời gian thực – phát hiện escherichia coli sinh độc tố shiga (stec) và các định các nhóm huyết thanh O157, O111, O26, O103 và O145.
8. Alaeddino~lu FASaNG (1998) A rapid and simple method for staining of the crystal protein of Bacillus thuringiensis. Journal of Industrial Microbiology 3: 227-229.
9. Chang, Y.-H., Shangkuan, Y.-H., Lin, H.-C., & Liu, H.-W. (2003). PCR Assay of the groEL Gene for Detection and Differentiation of Bacillus cereus Group Cells. Applied and environmental microbiology, 69(8), 4502–4510.
10. Chelliah, R., Wei, S., Park, B. J., Rubab, M., Banan-Mwine Dalirii, E., Barathikannan, K., Jin, Y. G., & Oh, D. H. (2019). Whole genome sequence of Bacillus thuringiensis ATCC 10792 and improved discrimination of Bacillus thuringiensis from Bacillus cereus group based on novel biomarkers. Microbial Pathogenesis, 129, 284–297.
11.Dzieciol, M., Fricker, M., Wagner, M., Hein, I., & Ehling-Schulz, M. (2013). A novel diagnostic real-time PCR assay for quantification and differentiation of emetic and non-emetic Bacillus cereus. Food Control, 32(1), 176–185.
12.Rebecca LH, Zothansanga Singh BP, Gurusubramanian G, Senthil NK. DNA finger printing of Bacillus thuringiensis based on repetitive DNA sequences using ERIC-PCR. Sci Vis. 2011;11(3):147–154.
13. Travers RS, Martin PA, Reichelderfer CF (1987) Selective Process for Efficient Isolation of Soil Bacillus spp. Appl Environ Microbiol 53: 1263-6
14.Thiery I and Frachon E (1997). Bacteria: identification, isolation, culture and preservation of entomopathogenic bacteria. In Lawrence A Lacey. Manual of Techniques in Insect Pathology, Cap. III-1, Biological Techniques Series, Academic Press, London, p. 55-75.
TS. Ninh Thị Thảo1, TS. Nông Thị Huệ1, Phạm Văn Tuấn2, Nguyễn Thị Quỳnh Anh2, Đỗ Đức Mạnh2
1GVHD, 2Lớp K62CNSHE, Khoa CNSH
(Nguồn: https://vnua.edu.vn/)