Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hay còn gọi là Thạch hộc thiết bì, là một loài lan có giá trị kinh tế cao. Cây có nhiều giá trị dược học quý như chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm giãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng [4]. Do nhu cầu cây giống ngày càng cao nên việc nghiên cứu về nhân giống Thạch hộc tía thông qua nuôi cấy in vitro là rất cần thiết. Các nghiên cứu vi nhân giống lan Thạch hộc tía đã được một số nhà khoa học trong nước tiến hành [10]. Gần đây, các nhà khoa học trên thế giới cũng tập trung tìm điều kiện vi nhân giống lan Thạch hộc tía [3, 4, 8].

Chitosan, chất dẫn xuất khử acetyl của chitin có nguồn gốc từ vách tế bào của nấm, vỏ của các loài giáp xác, biểu bì của côn trùng và một số loài tảo. Chitosan có khá nhiều đặc tính hấp dẫn như kích thích sự phát triển của thực vật, bảo vệ thực vật, kháng nấm, làm tăng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, thân thiện với môi trường vì dễ dàng phân hủy sinh học [6, 9]. Chitosan đã được chứng minh là làm tăng năng suất của một số loài cây nông nghiệp [16].

Hiện nay, nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã chỉ ra nhiều lợi ích tích cực của chitosan trong vi nhân giống lan [1, 2, 7]. Cụ thể, chitosan cho thấy hiệu quả cải thiện sự nảy nầm hạt, tăng sinh PLBs, tăng chất lượng cây con của một số loài lan, tạo điều kiện thuận lợi cho sự thuần dưỡng cây con ở điều kiện ex vitro [9].

  Vì vậy, nghiên cứu tiến hành bổ sung chitosan vào môi trường nuôi cấy nhằm nâng cao khả năng tăng sinh và tái sinh chồi từ PLBs lan Thạch hộc tía.

PLBs lan Thạch hộc tía được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách khoa, Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường Murashige và Skoog (1962) có hàm lượng khoáng đa lượng giảm đi một nửa (MS ½) bổ sung myo inositol 100 mg/L, sucrose 30 g/L, nước dừa 10%, agar 7,5 g/L, pH 5,8. Chitosan dùng trong thí nghiệm được cung cấp bởi công ty Bio Basic (có nguồn gốc từ vỏ cua, mức độ khử acetyl 90%). Chitosan được hòa tan bằng dung dịch acetic acid 2% và được tiến hành thêm nước cất.

Mẫu cấy được nuôi ở nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm trung bình 70%, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 4000 lux.

Mẫu cấy là cụm PLBs lan Thạch hộc tía 1 tháng tuổi, khối lượng 0,2 g/cụm (hình 1). Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản bổ sung BA 1,5 mg/L, NAA 0,1 mg/L và chitosan với các nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 mg/L hoặc không có chitosan (mẫu đối chứng).

Trọng lượng tươi và hình thái PLBs được ghi nhận sau 60 ngày nuôi cấy.
Gia tăng trọng lượng tươi PLBs = (trọng lượng lúc sau - trọng lượng ban đầu)/ trọng lượng ban đầu. 

Mẫu cấy là cụm PLBs lan Thạch hộc tía 1 tháng tuổi, khối lượng 0,2 g/cụm (Hình 1). Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản bổ sung BA 0,2 mg/L và chitosan với các nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 mg/L hoặc không có chitosan (mẫu đối chứng).

Tỉ lệ tái sinh chồi, số chồi tái sinh/ mẫu cấy, chiều cao và hình thái chồi được ghi nhận sau 60 ngày nuôi cấy.

Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm thống kê SPSS phiên bản 2019, phương pháp ANOVA và Duncan test.

Trong các chất hữu cơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy, chitosan nhận được sự quan tâm trong những năm gần đây vì hiệu quả tích cực của hợp chất này trong vi nhân giống lan [6].
Sau 21 ngày nuôi cấy, mẫu cấy PLBs có sự tăng sinh rõ rệt, hình thành các PLBs mới. Mẫu PLBs tăng sinh tốt trên các môi trường bổ sung chitosan 5 - 15 mg/L. Ở các nghiệm thức bổ sung chitosan 20 và 25 mg/L, mẫu cấy có màu vàng nhạt (Hình 2).

Sau 60 ngày nuôi cấy, các nghiệm thức có bổ sung chitosan từ 5 - 20 mg/L đều cho sự gia tăng trọng lượng cao hơn so với mẫu trên môi trường đối chứng. Kết quả tốt nhất thu được ở nồng độ chitosan 10 mg/L. Trên môi trường này, cụm PLBs có sự gia tăng trọng lượng tươi cao nhất, cao gấp 2,4 lần so với mẫu đối chứng (Bảng 1). Tác dụng tăng sinh PLBs của chitosan cũng đã được báo cáo trong một số nghiên cứu khác. PLBs nhân nhanh tốt trên môi trường Vacin Went và New Dogashima lỏng bổ sung chitosan 10 mg/L [15]. Rahmah (2015) đã báo cáo sự hình thành PLBs, đường kính cụm và sự gia tăng trọng lượng tươi PLBs cao nhất thu được từ mẫu Dendrobium manni được nuôi cấy trên môi trường bổ sung chitosan 1 mg/L [13]. Restanto (2016) nhận thấy môi trường nuôi cấy bổ sung chitosan ở nồng độ 15 mg/L cho kết quả tăng sinh PLBs của lan Dendrobium sp. tốt nhất [14].  

Số chồi tái sinh/ mẫu thu được cao nhất cũng trên môi trường có bổ sung chitosan 10 mg/L (16,67 chồi). Chiều cao chồi trung bình là 1,26 mm, cao hơn so với các nghiệm thức còn lại. Chitosan có thể tạo ra tín hiệu tổng hợp hormone thực vật như gibberellin, thúc đẩy sự tăng trưởng và phát triển của mẫu cấy [16].

Ngoài vai trò thúc đẩy tăng trưởng, chitosan hoạt động như một chất kích thích đối với một số phản ứng đáp ứng với stress ở thực vật. Chitosan thúc đẩy sự hình thành H2O2. Hợp chất H2O2 này hoạt động như một phân tử truyền tín hiệu. Sự gia tăng nồng độ H2O2 ở mức độ vừa phải sẽ dẫn đến tăng hàm lượng cytokinin nội sinh [2]. Acemi (2018) đã nhận thấy chitosan có hoạt tính gần giống cytokinin hơn là auxin [1]. Nhóm nghiên cứu nhận định, chitosan (với mức độ polymer hóa được xác định rõ) khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ phù hợp có thể tạo ra các hiệu ứng tương tự như jasmonic acid và BA trong nuôi cấy mô lan [2]. 

Về mặt hình thái, trên môi trường đối chứng và có bổ sung nồng độ chitosan thấp (5, 10 mg/L), PLBs có màu xanh, tăng trưởng tốt. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ chitosan lên cao hơn (15 - 25 mg/L), cụm PLBs có màu vàng nhạt. Kích thước PLBs cũng có sự khác biệt giữa các nghiệm thức. Trên các môi trường có nồng độ chitosan cao (15 mg/L - 25 mg/L), PLBs có kích thước nhỏ và ít tái sinh chồi hơn (Hình 3). Ở nồng độ chitosan 25 mg/L, sự gia tăng trọng lượng tươi thấp hơn mẫu đối chứng 1,29 lần (bảng 1). Chitosan được bổ sung ở nồng độ cao đã được báo cáo là ức chế sự tăng trưởng của mẫu cấy và gây chết tế bào [11, 13]. Pornpeanpakdee (2010) đã tiến hành thí nghiệm xác định ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng trưởng của PLBs lan Dendrobium ‘Eiskul’. Kết quả cho thấy, chitosan ở nồng độ quá cao (80 mg/L) đã ức chế sự tăng sinh của PLBs [12].

Từ các kết quả về số liệu và hình thái thu được, chitosan được bổ sung ở nồng độ 10 mg/L là phù hợp cho sự tăng sinh PLBs lan Thạch hộc tía.

            Sau 14 ngày nuôi cấy, các mẫu cấy bắt đầu tái sinh chồi (Hình 4). Mẫu đối chứng và mẫu trên môi trường có chitosan ở nồng độ 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L tái sinh chồi nhanh hơn các mẫu ở nghiệm thức bổ sung chitosan ở nồng độ cao (20 mg/L và 25 mg/L).

Hình 4: Cụm PLBs sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi (thanh kích thước 1 cm)

(a) chitosan 0 mg/L, (b) chitosan 5 mg/L, (c) chitosan 10 mg/L,
(d) chitosan 15 mg/L, (e) chitosan 20 mg/L, (f) chitosan 25 mg/L

Bảng 2. Ảnh hưởng của chitosan lên sự tái sinh chồi từ PLBs lan
Thạch hộc tía sau 60 ngày nuôi cấy

Những mẫu tự khác nhau (a, b) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong phép thử Duncan.

Sau 60 ngày nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh chồi ở tất cả nghiệm thức là 100%. Số chồi tái sinh/ mẫu đạt cao nhất ở nghiệm thức bổ sung chitosan 5 mg/L (82,5 chồi/ mẫu cấy). Các nghiệm thức bổ sung chitosan 10 - 20 mg/L cho kết quả không có sự khác biệt về mặt thống kê so với đối chứng. Khi bổ sung chitosan với nồng độ cao hơn (25 mg/L), số chồi tái sinh/ mẫu là thấp nhất (36,5 chồi) (Bảng 2). 

            Về mặt hình thái, trên các môi trường bổ sung chitosan nồng độ cao (20 mg/L và 25 mg/L), chồi có màu xanh nhạt hơn so với các nghiệm thức còn lại (Hình 5). Điều này cho thấy hàm lượng cao chitosan có tác động xấu đối với sự tái sinh chồi từ PLBs. Việc sử dụng chitosan với nồng độ cao có thể gây ra stress đối với mẫu cấy lan. Nồng độ chitosan phù hợp cần được khảo sát bằng thực nghiệm, ảnh hưởng của chitosan có thể khác nhau giữa các loài [2].

            Trong các nghiên cứu khác, sự bổ sung chitosan vào môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tái sinh chồi từ PLBs cũng thu được nhiều kết quả khả quan. Năm 2006, Nge và cộng sự khi sử dụng oligo chitosan vào môi trường nuôi cấy protocorm lan Dendrobium phalaenopsis ở nồng độ 20 mg/L đã cho sự tái sinh chồi tối ưu (5 -7 cây con, trong 12 tuần) [9]. Chitosan thúc đẩy sự hình thành lá non từ PLBs và sự tái sinh chồi tốt nhất thu được trên môi trường New Dogashima bổ sung chitosan 20 mg/L. Số lượng trung bình là 66 lá sau 8 tuần nuôi cấy [15]. Pornpienpakdee (2010) đã báo cáo trên môi trường có bổ sung oligo chitosan 20 mg/L, số lượng chồi mới hình thành từ PLBs cao hơn 3 lần so với đối chứng sau 4 tháng nuôi cấy. Việc bổ sung chitosan vào môi trường với loại và nồng độ phù hợp không những làm tăng số lượng chồi tái sinh mà còn làm tăng chất lượng của chồi [12].

Kananont (2010) nhận thấy tác động của chitosan trong quá trình vi nhân giống lan phụ thuộc vào loài và giai đoạn phát triển của mẫu cấy. Nhóm tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan lên quá trình vi nhân giống lan Dendrobium bigibbum var. compactum. Phần lớn các loại chitosan được khảo sát đều không làm tăng tỉ lệ nảy mầm, nhưng lại có hiệu quả tốt giúp tăng sinh protocorm loài lan này [5].
​
Do đó, việc tìm ra loại và nồng độ chitosan phù hợp cho từng loài cây, từng giai đoạn phát triển cụ thể cần được tiến hành để tăng cường sự phát triển của mẫu cấy.

 Chitosan có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng sinh PLBs và tái sinh chồi của lan Thạch hộc tía trong nuôi cấy in vitro. Chitosan được bổ sung ở nồng độ thích hợp góp phần kích thích sự tăng trưởng của mẫu cấy. Nồng độ chitosan phù hợp để tăng sinh PLBs và tái sinh chồi lan Thạch hộc tía lần lượt là 10 và 5 mg/L. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tiềm năng sử dụng chitosan bên cạnh các chất điều hòa sinh trưởng thực vật để nâng cao hiệu quả trong vi nhân giống các loài lan.
 
Lời cảm ơn:
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Trường Đại học Bách khoa - Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh trong khuôn khổ đề tài mã số T- KTHH-2020-52.

VÕ THANH PHÚC - VÕ THỊ TUYẾT TRINH (Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh)​