TÓM TẮT:
Cao chiết lá và trái quách với dung môi ethanol 96% và methanol 96% được sử dụng để khảo sát khả năng kháng oxy hoá với DPPH, H2O2 và kháng vi sinh vật. Kết quả cho thấy, khả năng kháng oxy hóa của cao chiết lá với dung môi ethanol cho hiệu quả cao nhất với IC50 bằng 59,92 mg/mL, trong khi cao chiết trái với ethanol cho giá trị IC50 ở 457,64mg/mL ở phương pháp DPPH. Đối với phương pháp khử H2O2, cao chiết lá cho kết quả cao hơn cao chiết trái với IC50 của cao chiết lá - ethanol là 70,92 mg/mL. Về khả năng kháng vi sinh vật, ở nồng độ 500 mg/mL, cao chiết lá và trái ảnh hưởng mạnh nhất đến sự phát triển của Escherichia coli. Đối với Bacillus subtilis, chỉ có cao chiết trái với nồng độ từ 300 mg/mL mới có khả năng ức chế.
Từ khóa: Cao chiết, trái quách, kháng oxy hóa, kháng khuẩn.
1. Đặt vấn đề
Cây quách (woody aple) có tên khoa học là Limonia acidissima L. (Ngô Quốc Luân et al., 2014; Vijayvargia và Vijayvergia, 2014), cùng họ với các loại cây có múi Citreae (Routacea). Cây quách được trồng nhiều ở Nam bộ, là một cây đặc sản của Trà Vinh. Trái quách được chế biến ra nhiều thực phẩm thức uống đặc biệt như cơm quách chua thanh, sinh tố quách dầm, rượu quách.
Gốc oxy hóa tự do trong cơ thể là nguyên nhân của nhiều căn bệnh như tiểu đường, béo phì, bệnh tim mạch và bệnh về trí nhớ, sự lão hóa và các căn bệnh tuổi già, bệnh ung thư (Alfadda và Sallam, 2012; Waris và Ahsan, 2006). Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tính kháng oxy hóa của dịch chiết từ trái quách (Vasant và Narasimhacharya, 2011; Ilango và Chitra, 2010). Tuy nhiên, quách là loài cây cho trái theo mùa, vì vậy, việc nghiên cứu và sử dụng các chất kháng oxy hóa từ trái quách sẽ bị gián đoạn và khó khăn.
Quách là loài cây cho lá quanh năm, do vậy nghiên cứu và sử dụng lá quách thuận tiện hơn. Ngoài những nghiên cứu về tính kháng oxy hóa, nghiên cứu về tính kháng khuẩn của dịch chiết từ trái quách cũng đã được công bố. Những dữ liệu này sẽ có ích cho việc khai thác tiềm năng công dụng của trái quách.
Các loài cây thuộc họ cây có múi mọc ở những điều kiện địa lý khác nhau sẽ cho ra đặc tính kháng khuẩn và đặc tính kháng oxy hóa khác nhau (Phi et al., 2015). Điều này có đúng với cây quách ở Việt Nam và ở Ấn Độ hay không vẫn chưa được kiểm chứng.
Ở Trà Vinh, quách là loài cây ăn trái khá được ưa chuộng. Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu có hệ thống về khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn từ lá và trái của cây quách ở Trà Vinh. Vì vậy, nghiên cứu “Khảo sát tính kháng oxy hóa và kháng vi sinh vật của dịch chiết từ trái và lá cây quách (Limonia acidissima L.)” được thực hiện nhằm đánh giá khả năng kháng oxy hoá và kháng vi khuẩn của cao chiết trái và lá cây quách để làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về sau trong việc gia tăng giá trị của loại cây này.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu: Lá và trái quách được thu hoạch từ những cây khỏe mạnh ở TP. Trà Vinh. Cây được lựa chọn dựa vào đặc điểm hình thái như thân, lá và trên 10 năm tuổi. Lá không được quá già hoặc quá non, trái già vừa chín. Trái được thu hoạch vào tháng 11, trái quách lấy mẫu phải già, ruột vừa trở màu nâu. Lá có thể thu hái vào bất cứ thời điểm nào trong năm. Mẫu được rửa dưới vòi nước để loại bỏ bụi, đất và làm khô mẫu trong không khí. Mẫu lá được nghiền mịn, ngâm với dung môi (ethanol hoặc methanol 96%) và xử lý bằng sóng siêu âm với công suất 120W trong 60 phút. Sau đó, được lọc bằng Na2SO4 khan kết hợp với hút chân không và tiến hành cô quay ở 50oC cùng với hệ thống làm lạnh. Cao thô được sấy ở 40oC trong vòng 48 giờ. Mẫu trái được nghiền chung vỏ, cơm, hạt, để khô và xử lý như mẫu lá.
Vi sinh vật sử dụng bao gồm: Escheria coli ATCC 25922 (Gram âm) và Bacillus subtilis chọn từ bộ sưu tập Phòng thí nghiệm Sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ.
Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng DPPH: Thực hiện theo phương pháp DPPH của Nishaa và cộng tác viên (2012) và Bhalodia và cộng tác viên (2013).
Khảo sát khả năng khử gốc peroxide bằng H2O2: Thực hiện theo mô tả của Rahate và cộng sự (2016), có hiệu chỉnh.
Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật: Thực hiện theo phương pháp khuếch tán qua giếng thạch của Jaradat et al., (2014).
- Mỗi loại cao chiết pha loãng trong DMSO 100% để đạt được nồng độ.
- Escherichia coli được nuôi cấy trên môi trường LB, ở 37oC sau 24 giờ.
- Ampicillin pha loãng với nước cất khử trùng để đạt nồng độ.
Tạo dịch huyền phù vi sinh vật có mật số đạt 106 CFU/mL. Hút 50 µL dịch huyền phù vi sinh vật và trải đều trên môi trường thạch LB hiệu chỉnh, để ráo trong 15 phút.
Đục 5 giếng (đường kính 6 mm) sao cho mỗi giếng cách đều nhau. Hút 20 µL lần lượt các dung dịch: Đối chứng âm DMSO 100%, các nghiệm thức cao chiết và cuối cùng là đối chứng dương vào mỗi giếng trên đĩa petri.
Để yên trong 15 phút. Sau đó ủ ở 37oC.
Đo đường kính vòng kháng khuẩn tại các mốc thời gian.
Xử lý số liệu: Các số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel. Phần mềm Minitab 16 được sử dụng để phân tích phương sai (ANOVA). Các giá trị trung bình được kiểm định bằng phép thử Tukey để kiểm tra sự khác biệt.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết được xác định dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH và kết quả được thể hiện thông qua giá trị IC50 trong mỗi nghiệm thức cao chiết (Bảng 1). Giá trị IC50 càng nhỏ thì khả năng khử gốc tự do DPPH càng mạnh và ngược lại.
Bảng 1. Khả năng khử gốc tự do DPPH của các loại cao chiết
Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột, cùng chỉ tiêu khảo sát có các mẫu tự theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phép thử Tukey ở mức 1%.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, cả 4 nghiệm thức đều có khả năng khử gốc tự do DPPH và giá trị IC50 của cao chiết đều lớn hơn nhiều so với của vitamin C. Do vậy, mặc dù có khả năng kháng oxy hóa, nhưng khả năng kháng oxy hóa của cao chiết lá và trái quách không phải là rất mạnh. Theo đó, ở các dung môi methanol và ethanol, các nghiệm thức cao trái đều có IC50 cao hơn nhiều so với các nghiệm thức cao lá. Điều này cho thấy các nghiệm thức cao lá có khả năng khử gốc tự do DPPH mạnh hơn nhiều so với các nghiệm thức cao trái (các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1%).
3.2. Khả năng khử gốc tự do H2O2
Khả năng khử gốc tự do H2O2 của cao chiết lá và trái quách được thể hiện thông qua giá trị IC50 và được trình bày trong Bảng 2. Giá trị IC50 càng thấp thì khả năng khử gốc tự do H2O2 càng mạnh và ngược lại.
Theo kết quả, trừ nghiệm thức trái - ethanol (IC50 = 286,89 ± 2,67), tất cả các nghiệm thức đều cho thấy khả năng khử gốc tự do H2O2 tương đương hoặc mạnh hơn vitamin C, thể hiện ở giá trị IC50 tương đương hoặc thấp hơn giá trị IC50 của vitamin C.
Bảng 2. Khả năng khử gốc tự do H2O2 của các loại cao chiết
Ghi chú: Các giá trị trung bình trong cùng một cột, cùng chỉ tiêu khảo sát có các mẫu tự theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phép thử Tukey ở mức 5%.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, khả năng khử gốc tự do H2O2 của các nghiệm thức cao chiết lá quách đều cao hơn so với khả năng khử gốc tự do của các nghiệm thức cao chiết trái quách, trong trường hợp dùng dung môi methanol hay ethanol. Theo đó, khả năng khử gốc tự do H2O2 của cao chiết ethanol của lá quách mạnh hơn so với cao chiết methanol của lá quách. Ngược lại, khả năng khử gốc tự do H2O2 của cao chiết ethanol của trái quách lại yếu hơn khả năng khử gốc tự do của cao chiết methanol trái quách.
Từ kết quả khử gốc tự do DPPH và kết quả khử gốc tự do H2O2 cho thấy có sự tương quan giữa khả năng khử gốc tự do của cao chiết lá và trái quách với khả năng khử gốc tự do H2O2 của cao chiết lá và trái quách. Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết càng mạnh thì khả năng khử gốc tự do H2O2 của cao chiết càng mạnh. Tuy nhiên, vẫn có sự khác biệt tương đối giữa giá trị IC50 của các nghiệm thức cao chiết trong kết quả thí nghiệm khử gốc DPPH với giá trị IC50 của các nghiệm thức cao chiết trong kết quả thí nghiệm khử gốc tự do H2O2. Theo đó, tỉ lệ IC50 của nghiệm thức cao ethanol của trái quách đối với nghiệm thức cao methanol của trái quách trong thí nghiệm khử gốc tự do DPPH là 1,08. Tỉ lệ IC50 của hai nghiệm thức này trong thí nghiệm khử gốc tự do H2O2 là 2,16 - gần gấp 2 lần.
3.3. Khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli
Hình 1: Khả năng kháng Escherichia coli của các loại cao chiết sau 96 (500 mg/mL)
Kết quả thử nghiệm khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli được thể hiện trong Bảng 3. Tất cả các nồng độ thử nghiệm (100, 300 và 500 mg/mL) đều có khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli sau 24h nuôi cấy, đồng thời khả năng kháng khuẩn tăng theo nồng độ cao chiết. Ở nồng độ cao chiết 100 mg/mL, đường kính vòng vô khuẩn dao động trong khoảng 2,13 đến 3,13 mm. Khi tăng nồng độ lên 5 lần thì đường kính vòng vô khuẩn tăng lên và dao động trong khoảng 5,25 đến 7,75 mm.
Bảng 3. Khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli của các loại cao chiết
Ghi chú: Giá trị là trung bình đường kính vòng vô khuẩn (mm) ± độ lệch chuẩn (SD); các chữ cái theo sau trong cùng một cột giống nhau thì sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%; LE: Cao chiết ethanol lá, LM: Cao chiết methanol lá, TRE: Cao chiết ethanol trái, TRM: Cao chiết methanol trái.
Khi so sánh hiệu quả ức chế vi khuẩn Escherichia coli của các cao chiết cho thấy cao chiết methanol từ trái quách có khả năng kháng khuẩn tương đương cao chiết lá quách (cả hai dung môi ethanol và methanol) ở nồng độ 100 mg/mL (p > 0,05). Ở nồng độ 300 mg/mL, khả năng ức chế của cao chiết methanol lá quách thấp hơn các nghiệm thức còn lại (p < 0,05). Khi tăng nồng độ lên 500 mg/mL, khả năng ức chế vi khuẩn E. coli của cao chiết methanol và ethanol lá khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Kết quả này cũng tương tự với cao chiết từ trái. Đồng thời, cao chiết trái có khả năng ức chế cao hơn cao chiết lá ở cả 2 dung môi.
3.4. Khả năng kháng vi khuẩn Bacillus subtilis
Hình 2: Khả năng kháng Bacillus subtilis của các loại cao chiết sau 96 giờ (300 mg/mL)
Khả năng kháng vi khuẩn Bacillus subtilis của các cao chiết được trình bày trong Bảng 4. Kết quả ghi nhận chỉ có cao chiết trái với nồng độ 300 và 500 mg/mL có khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus subtilis.
Bảng 4. Khả năng kháng vi khuẩn Bacillus subtilis của các loại cao chiết
Ghi chú: Giá trị là trung bình đường kính vòng vô khuẩn (mm) ± độ lệch chuẩn (SD); các chữ cái theo sau trong cùng một cột giống nhau thì sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%; LE: Cao chiết ethanol lá, LM: Cao chiết methanol lá, TRE: Cao chiết ethanol trái, TRM: Cao chiết methanol trái; -: không có hoạt tính.
Cụ thể, ở nồng độ 300 mg/mL, khả năng kháng khuẩn của cao chiết methanol trái cao hơn cao chiết ethanol với vòng vô khuẩn lần lượt là 3,00 ± 0,41 và 2,13 ± 0,25 mm, khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức 5%. Ở nồng độ 500 mg/mL, sự khác biệt về khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus subtilis là không ý nghĩa (p > 0,05).
Sự ức chế khác nhau của các loại cao chiết trên các loại vi sinh vật có thể giải thích là do sự hiện diện của các hợp chất thứ cấp (Njateng et al., 2017). Các nghiên cứu trước đây cho thấy, các nhóm hợp chất như saponin, phenol, tannin và alkaloid đều có hoạt tính kháng vi sinh vật (Faizi et al., 2003; Okoro et al., 2010; Pavithra et al., 2010; Selime et al., 2010). Ngoài ra, khả năng ức chế vi sinh vật còn phụ thuộc vào sự hiện diện của các đơn chất hay sự tương tác của các hợp chất trong cao chiết.
4. Kết luận
Về hoạt tính kháng oxy hóa, các nghiệm thức cao lá có khả năng khử gốc tự do DPPH mạnh hơn nhiều so với các nghiệm thức cao trái. Khả năng khử gốc tự do DPPH hiệu quả nhất ở nghiệm thức lá - ethanol với giá trị IC50 là 59,92 mg/mL và thấp nhất ở nghiệm thức trái - ethanol có giá trị IC50 là 457,64 mg/mL. Về khả năng khử gốc peroxide H2O2, các nghiệm thức cao chiết lá quách đều cao hơn so với khả năng khử gốc tự do của các nghiệm thức cao chiết trái quách. Nghiệm thức lá - ethanol với giá trị IC50 là 70,92 mg/mL cho hiệu quả kháng oxy hóa cao nhất, trong khi đó, nghiệm thức trái - ethanol với giá trị IC50 là 286,89 mg/mL có khả năng kháng oxy hóa kém nhất.
Cao chiết lá và trái ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtilis. Nồng độ 500 mg/mL, cao chiết ảnh hưởng mạnh nhất đến sự phát triển Escherichia coli. Đối với vi khuẩn Bacillus subtilis, chỉ có cao chiết trái quách với nồng độ từ 300 mg/mL mới có khả năng ức chế.
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1. Ngô Quốc Luân, Lê Thị Hồng Phượng, Đặng Huỳnh Giúp, Ngô Khắc Không Minh, (2014). Bước đầu khảo sát thánh phần hóa học trái quách ở Trà Vinh. Tạp chí Dược liệu. (19), 358-362.
2. Alfadda A. A., and R. M. Sallam. (2012). Reactive oxygen species in health and disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology, Volume 2012, Article ID 936486, 14 pages, doi:10.1155/2012/936486
3. Bhalodia, N.R., P.B. Nariya, R.N. Acharya, and V.J. Shukla, (2013). In vitro antioxidant activity of hydro alcoholic extract from the fruit pulp of Cassia fistula Linn. Ayu, 34(2), 209-214.
4. Ilango, K., and V. Chitra, (2009). Antidiabetic and antioxidant activity of Limonia acidissima Linn. in alloxan induced rats. Der Pharmacia Lettre. 1(1), 117-125.
5. Jaradat, N.A., I.S. Ala’khader, and M. Abu-Hadid, (2014). Exhaustive extraction and screening the biological activities of Heliotropium hirsutissimum (hairy heliotrope): A member of palestinian flora. Asian journal of pharmaceutical and clinical research, 7(5), 207-210.
6. Nishaa, S., M. Vishnupriya, J.M. Sasikumar, P.C. Hephzibah, and V.K. Gopalakrishnan, (2012). Antioxidant activity of ethanolic extract of Maranta arundinacea L. tuberous rhizomes. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 5(4), 85-88.
7. Phi, N. T. L., P.V. Hung, P.T.L. Chi, and P.D. Tuan, (2015). Impact of growth locations and 8. genotypes on antioxidant and antimicrobial activities of citrus essential oils in Vietnam. Journal of Essential Oil Bearing Plants, 18(6), 1421-1432.
8. Rahate, K. P., R. padma, N. G. Parkavi, and Renjith (2013). Quantitative estimation of tannins, phenols and antioxidant activity of methanolic extract of Imperata cylindrical. International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, 4(1), 73-77.
9. Vasant, R.A., and AVRL. Narasimhacharya, (2011). Alleviation of fluoride-induced hepatic and renal oxidative stress in rats by the fruit of Limonia acidissima. Fluoride, 44, 14-20.
10. Vijayvargia P., and R. Vijayvergia, (2014). A Review on Limonia acidissima L.: Multipotential Medicinal Plant. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., 28 (1),191-195.
EXAMINING THE ANTIOXIDANT ACTIVITY AND THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF THE LEAF AND THE FRUIT EXTRACTS OF Limonia acidisma L. • Postgraduate student CHAU PHONG CHAU • Ph.D NGUYEN DUC DO • Master. TRAN VAN BE NAM • Ph.D DO TAN KHANG • Assoc.Prof. Ph.D TRAN NHAN DUNG Biotechnology Research and Development Institute, Can Tho University ABSTRACT: The leaf and the fruit extracts of Limonia acidisma L. with 96% ethanol and 96% methanol were examined in this study to test the antioxidant activity with DPPH, H2O2 and the antibacterial activity of Limonia acidisma L. This study’s results show that the extract of Limonia acidisma L. leaves with ethanol has the highest antioxidation with IC50 of 59.92 mg/mL. Meanwhile, the extract of Limonia acidisma L. fruit with ethanol has the highest IC50 of 457.64 mg/mL with the use of DPPH oxidation method. When using the H2O2 reduction method, the leaf extract has the IC50 of 70.92 mg/mL, higher than that of the fruit extract of Limonia acidisma L. For the antibacterial activity, at the concentration of 500 mg/mL, the leaf and the fruit extract of Limonia acidisma L. have the highest inhibition to Escerichia coli. Only the fruit extract with the concentration of at least 300 mg/mL could inhibit the growth of Bacillus subtilis. Keywords: Extract, Limonia acidisma L., antioxidant activity, antimicrobial activity. |
CHÂU PHONG CHÂU 1, TS. NGUYỄN ĐỨC ĐỘ 2 , ThS. TRẦN VĂN BÉ NĂM 2
TS. ĐỖ TẤN KHANG 2 , PGS. TS. TRẦN NHÂN DŨNG 2
1 Học viên cao học Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ
2 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ
[Tạp chí Công Thương - Các kết quả nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ, Số 28, tháng 11 năm 2020]
Đăng nhập
