Theo kinh nghiệm dân gian và một số tài liệu y học thì cây đu đủ (Carica papaya L.) có khả năng tiêu u, ức chế một số tế bào ung thư. Một số nghiên cứu cho biết, trong hoa và lá đu đủ có chứa các chất có hoạt tính chống ung thư và thể hiện hoạt tính trong điều kiện in vitro. Cặn chiết methanol của lá đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 µg/mL, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7 (T h ảo et al., 2008). Kết quả thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào các dòng tế bào ung thư phổi (A549), ung thư gan (Hep3B) và ung thư vú (MCF-7) của 11 phân đoạn từ 3 dịch chiết tổng cho thấy: Các phân đoạn N/ET, N/N; M/ET, M/M; E/H, E/ET, E/E đều không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Các phân đoạn khác thể hiện hoạt tính: M/H gây độc tế bào A549; N/C thể hiện hoạt tính gây độc tế A549 và MCF-7; M/C thể hiện hoạt tính gây độc trên cả ba dòng tế bào A549, Hep3B và MCF-7 và E/C gây độc tế bào Hep3B (Liên et al., 2019). Phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 = 18,44 µg/mL), ung thư phổi LU-1 (IC50 = 18,21 µg/mL) và ung thư vú MCF-7 (IC50 = 19,16 µg/mL). Đồng thời hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine phân lập từ cặn CH2 Cl2 của lá đu đủ lần đầu tiên được chứng minh có hoạt tính gây độc mạnh trên cả bốn dòng tế bào ung thư người: ung thư biểu mô KB, ung thư máu HL-60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL) (Hà, 2014). Các nhà khoa học đã phát hiện và nghiên cứu chức năng của hàng chục loại cytokines trong hệ thống miễn dịch liên quan tới bệnh ung thư như: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α … (Thao et al., 2007; Mihara et al., 2012; Tsukamoto et al., 2018; Whlcher et al., 1990). Tuy nhiên, hiện chưa có báo cáo nào xác định hoạt tính cảm ứng miễn dịch kháng u và đánh giá ho ạt tính chống ung thư trong điều kiện kiện in vivo trên động vật thử nghiệm, cũng như chưa có so sánh hoạt tính chống ung thư của hoa và lá, của mẫu tươi và mẫu khô của cây đu đủ đực. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư, cảm ứng miễn dịch kháng ung thư in vitro, cũng như hoạt tính kháng u trên chuột của các dịch chiết từ lá và hoa cây đu đủ đực thu từ khu vực tỉnh Hà Tĩnh, Việt Nam.
Hoa và lá của cây đu đủ đực (Caria papaya L.) được thu hái vào khoảng tháng 5 đến tháng 12 năm 2019 ở địa bàn huyện Cẩm Xuyên, tỉnh Hà Tĩnh do nhà thực vật Phạm Hồng Ban làm việc tại trường Đại học Vinh định danh khoa học; Chuột nhắt thuần chủng dòng BALB/c do Phòng Thử nghiệm Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp; Các dòng tế bào: MCF-7, A549, HT29, Huh 7R, HEK-293, RAW 264.7, LLC do GS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp; Môi trường DMEM, huyết thanh phôi bò (Fetal bovine serum- FBS) của GIBCO, Invitrogen, TCA, SRB, Ellipticine (Sigma), đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Biotek, ELx800).
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tạo dịch chiết và cao lỏng
Mỗi loại mẫu hoa, lá được chiết theo phương pháp ngâm dầm với dung môi cồn 90o trong thời gian 48 giờ sau đó lọc dịch chiết, cô đuổi dung môi tạo cao lỏng: 50 gam bột khô hoa hoặc lá; 362 gam hoa tươi hoặc 305 gam lá tươi tạo được 5 mL cao lỏng mỗi loại. Có 4 loại cao lỏng thu được là: cao lỏng hoa khô, cao lỏng hoa tươi, cao lỏng lá khô, cao lỏng lá tươi.
Phương pháp nuôi cấy tế bào
Các dòng tế bào MCF-7, A549, HT29, Huh 7R, HEK-293, RAW 264.7, LLC được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh phôi bò FBS, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate. Tế bào được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỷ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp
Phép thử xác định khả năng gây độc tế bào ung thư thực hiện theo phương pháp của Skehan et al. (1991), được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ NCI (National Cancer Institute) sử dụng làm phương pháp chuẩn để sàng lọc tìm chất chống ung thư từ năm 1991. Các tế bào ung thư được nuôi trong phiến vi lượng 96 giếng, được thử chất, nhuộm bằng SRB (sulforhodamine B) và đo hàm lượng ở bước sóng 515 nm bằng máy Microplate Reader (BioTek, ELx800).
Phép thử được lặp lại 3 lần. Ellipticine ở các nồng độ 10 µg/mL; 2 µg/mL; 0.4 µg/mL; 0.08 µg/mL được sử dụng như là chất đối chứng dương. DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính cảm ứng miễn dịch kháng u invitro
Tế bào RAW 264.7 được đưa ra các gi ếng của đĩa 96 giếng với nồng độ 2 x 105 tế bào/giếng, tế bào được nuôi ổn định trong tủ ấm CO2 qua đêm trước khi được ủ với mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau với sự có mặt của LPS (5 µg/mL) trong 24 giờ. Sau đó dịch nổi được thu lại, ly tâm để loại bỏ tế bào, và giữ ở - 20oC cho thí nghiệm tiếp theo. Sự sản suất IL-6 và IL-2 trong dịch nổi tế bào dưới tác động của mẫu thử được xác định bằng các bộ Mouse IL-2 (mouse) ELISA Kit và Mouse IL-6 (mouse) ELISA Kit (BIOVISION Inc., USA) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phương pháp thử nghiệm tiền lâm sàng xác định khả năng kháng khối u ung thư của dịch chiết lá đu đủ
Phương pháp thử nghiệm tiền lâm sàng được tiến hành theo Thao et al. (2008). Cụ thể là tế bào LLC được nuôi ở 37oC và 5% CO2, trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh phôi bò và 1% kháng sinh, khi tế bào phát triển đủ số lượng, tiến hành thu hoạch và tiêm vào bắp đùi chuột nồng độ 2 x 106 tế bào/con (là nồng độ gây u cho chuột thí nghiệm đạt 100%). Sau khi tiêm tế bào LLC 5 ngày thấy có u thì chia chuột thành các lô thử nghiệm. Theo đó, 24 chuột có u được chia làm 4 lô (6 chuột/lô) gồm: lô 1 uống mẫu với liều 3 mL/kg/ngày tương đương khối lượng mẫu lá tươi 30 g/kg/ngày; lô 2 uống mẫu với liều 6 mL/kg/ngày tương đương khối lượng mẫu lá tươi 60 g/kg/ngày; lô 3 là đối chứng bệnh lí uống nước với thể tích 3 mL/kg/ngày; lô 4 là đối chứng tham khảo uống Capecitabine liều 200 mg/kg/ngày; Theo dõi chuột hàng ngày, cân khối lượng và đo kích thước khối u sơ cấp tại vị trí tiêm 5-7 ngày/lần theo phương pháp của Ligo et al. (1991), Lee et al. (2006) để xác định khả năng ức chế khối u của mẫu nghiên cứu. Thể tích khối u được tính theo công thức của Iigo (1991): V = a ´ b2/2, trong đó, V: thể tích khối u; a: chiều dài khối u; b: đường kính khối u.
Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu được xử lí trên Excel, được trình bày dạng mean ± SE. Các thuật toán thống kê Student's t-test, F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng bệnh lý, với P < 0,05 được coi là sai khác có ý nghĩa thống kê.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Với phương pháp tạo cao chiết lỏng từ lá, hoa của cây đu đủ đực như đã trình bày, chúng tôi đã thu được các mẫu cao lỏng hoa tươi, cao lỏng hoa khô, cao lỏng lá tươi và cao lỏng lá khô để nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro. Khả năng gây độc tế bào ung thư được xác định thông qua giá trị IC50 là nồng độ gây chết 50% tế bào và được trình bày ở Bảng 1.
Kết quả trên cho thấy hai mẫu cao lỏng hoa tươi và cao lỏng hoa khô không thể hiện hoạt tính ở các nồng độ nghiên cứu trên các dòng tế bào ung thư sử dụng. Hai mẫu cao lỏng lá tươi và cao lỏng lá khô thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư nghiên cứu với giá trị IC50 từ 1,88 – 13,64 mg/mL. Trong đó, mẫu cao lỏng lá tươi có hoạt tính cao hơn rất nhiều so với cao lỏng lá khô (giá trị IC50 thấp hơn) vào cao nhất đối với dòng ung thư đại tràng (HT29) (IC50 = 1,88 mg/mL). Đối với dòng tế bào thường (HEK-293), giá trị IC50 của cao lỏng lá tươi cao hơn so với các dòng tế bào ung thư phổi (A549) và ung thư đại tràng (HT29), chứng tỏ mức độ gây hại của cao lỏng lá tươi đối với tế bào thường thấp hơn tế bào ung thư phổi và ung thư đại tràng. Trong một số nghiên cứu khác, hoạt tính gây độc tế bào của lá đu đủ thể hiện trên nhiều dòng tế bào ung thư như LU-1, MCF-7, KB… (Thảo et al., 2007; Hà, 2014). Hai mẫu cao lỏng lá tươi và cao lỏng lá khô cũng thể hiện hoạt tính với giá trị IC50 lần lượt là 4,91 mg/mL và 14,27 mg/mL trên dòng tế bào ung thư phổi (LLC) ở chuột - là dòng tế bào sử dụng để gây khối u in vivo. Như vậy, trong nghiên cứu này, hoạt tính gây độc tế bào của cao lỏng lá đu đủ đực tươi thể hiện rõ nét trên các dòng tế bào ung thư nghiên cứu và là cơ sở để chúng tôi lựa chọn cho thử nghiệm kháng khối u ung thư in vivo trên động vật.
Bảng 1. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu trên các dòng tế bào ở người.
Kết quả thử nghiệm hoạt tính cảm ứng miễn dịch kháng u trong điều kiện in vitro của cao lỏng lá tươi
Để sơ bộ tìm hiểu hoạt tính kháng ung thư của cao lỏng lá tươi từ cây đu đủ đực, khả năng cảm ứng miễn dịch kháng u trên mô hình tế bào RAW264.7 được đánh giá thông qua ảnh hưởng tới sự thay đổi sản sinh (tăng cường hay ức chế) các cytokines miễn dịch liên quan khối u là IL-2 và IL-6 của đại thực bào.
Khả năng sinh cytokine của mẫu thí nghiệm trên tế bào RAW264.7 kích ứng bằng LPS được trình bày ở Bảng 2 dưới đây.
Bảng 2. Khả năng sản xuất IL-2 và IL-6 của tế bào RAW 264.7 dưới sự tác động của cao lỏng lá tươi so với đối chứng âm.
Qua Bảng 2 chúng tôi nhận thấy mẫu cao lỏng lá tươi ức chế mạnh sự sản sinh IL-6 ở nồng độ 4 mg/mL, 0,8 mg/mL ở mức có ý nghĩa thống kê (P<0,01) tương ứng với mức ức chế 50,56% sức sản xuất IL-6 của đại thực bào ở nồng độ 4 mg/mL và 23,79% ở nồng độ 0,8 mg/mL (so với đối chứng âm, P<0,01). Khi nồng độ giảm xuống đến 0,16 mg/mL, mẫu không thể hiện khả năng ức chế sản suất IL-6. Tuy nhiên, mẫu không thể hiện khả năng cảm ứng sinh IL-2 ở các nồng độ nghiên cứu. Nhiều báo cáo cho thấy IL-6 có vai trò quan trọng trong điều hòa miễn dịch, tạo máu, viêm và oncogenesis bằng cách điều chỉnh tăng trưởng tế bào, kích hoạt gen, sự phát triển, sự sống còn và sự biệt hóa. IL-6 cũng cho thấy vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tạo mạch máu (angiogenesis) khi kích hoạt VEGF. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng IL-6 liên quan đến cơ chế phát triển và di căn của nhiều loại ung thư do tác động thúc đẩy sự sống sót của tế bào khối u (Tsukamoto et al., 2018), thúc đẩy sự phosphoryl hóa STAT3, sự giao tiếp giữa các tế bào ác tính và stroma, sự hình thành mạch (Milagre et al., 2015). Vì thế, rất nhiều báo cáo cho rằng việc ức chế quá trình sản xuất, truyền tín hiệu của IL-6 hay dùng kháng thể kháng IL-6 sẽ là đích hướng tới của các liệu pháp mới chữa trị bệnh ung thư (Thao et al., 2007; Mihara et al., 2012; Whlcher et al., 1990). Như vậy, kết quả thu được cho thấy một trong các cơ chế tiềm năng chống ung thư của cao lỏng lá tươi có thể là nhờ ức chế sự sản sinh IL-6.
Hoạt tính kháng khối u in vivo trên chuột bị gây u thực nghiệm của cao lỏng lá tươi
Khả năng kháng u của cao lỏng lá tươi được nghiên cứu trên mô hình chuột BALB/c gây u thực nghiệm bằng tế bào LLC. Thông qua các chỉ số về sự thay đổi khối lượng chuột (Hình 1), chúng tôi nhận thấy cao lỏng lá tươi không ảnh hưởng rõ rệt lên trọng lượng cơ thể động vật. Chuột ở tất cả các lô thí nghiệm tại thời điểm 28 ngày đều tăng trọng lượng so với thời điểm bắt đầu thí nghiệm nhưng không có sự sai khác thống kê so với đối chứng bệnh lí (P>0,05). Trọng lượng chuột ở lô đối chứng tham khảo có hiện tượng giảm ở mức có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Hình 1. Trọng lượng chuột thí nghiệm bị gây u khi thử nghiệm với cao chiết lá tươi từ cây đu đủ đực Hà Tĩnh.
Khả năng ức chế khối u là một chỉ tiêu rất quan trọng để đánh giá tác dụng kháng u của mẫu nghiên cứu. Kết quả ở Hình 2 cho thấy tác động của cao lỏng lá tươi đối với sự phát triển của khối u phụ thuộc vào liều dùng. Sau 28 ngày sử dụng cao lỏng lá tươi, thể tích khối u của chuột ở lô sử dụng liều 3 mL/kg/ngày không giảm so với đối chứng bệnh lí (P>0,05); còn thể tích khối u của chuột ở lô sử dụng liều 6 mL/kg/ngày giảm còn 9003,49 mm3, ức chế được 33,44% thể tích khối u so với lô đối chứng âm là 13527,21 mm3 (P<0,05).