TÓM TẮT:
Chitooligosaccharide là sản phẩm thủy phân của chitin được xúc tác bởi chitinase (EC 3.2.1.14), chitinase được ứng dụng nhiều trong y học, công nghiệp, nông nghiệp. Bài báo này tập trung vào sàng lọc các chủng vi khuẩn biển sinh chitinase, cho thấy chủng DS23 có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao và ổn định trên hai môi trường M1, K1. Chủng DS23 là vi khuẩn Gram (+), tế bào hình que, phát triển ở dải nhiệt độ 15-55°C, pH 5-11, chịu nồng độ muối đến 7,0% (w/v), sử dụng tốt các nguồn đường D-cellobiose, glycogen, D-manose, D-fructose, D-lactose, D-glucose và D-trehalose. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng DS23 cho thấy, độ tương đồng trình tự cao (>99%) so với gen tương ứng của chủng Bacillus licheniformis DSM (NR118996.1). Kết hợp đặc điểm sinh học và phân tích trình tự gen 16S rDNA chủng DS23 được định danh là Bacillus licheniformis DS23 (mã số GenBank GU004539). Chitinase từ chủng B. licheniformis DS23 xúc tác chuyển hoá colloidal chitin thành các oligomer gồm 2-6 đơn phân. Như vậy, chủng B. licheniformis DS23 có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chitooligosaccharides.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, sản lượng xuất khẩu tôm chế biến ở Việt Nam hàng năm đạt trung bình 1,5 tỷ USD. Hàng năm, các nhà máy chế biến tôm đã loại bỏ một lượng lớn phế liệu (vỏ và đầu tôm) ước chừng 100.000 tấn/năm [8]. Tuy nhiên, chỉ một phần nhỏ phế liệu này được tái sử dụng và chế biến thành các sản phẩm hữu ích khác như: thức ăn gia súc, gia cầm và phân bón… Một trong số những sản phẩm có tính ứng dụng cao được tạo ra từ các phế thải trên là chitin. Chitin là polyme sinh học không phân nhánh, cấu thành từ các đơn vị N-acetyl glucosamin (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1,4)- glucoside [12]. Chitooligosaccharide (COS) là dẫn xuất có hoạt tính sinh học và được ứng dụng nhiều trong y học do có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng cholesterol, chống ung thư, chữa trị các bệnh thoái hóa khớp, sử dụng làm vỏ bao cho các loại thuốc, hỗ trợ làm lành vết thương do bỏng nhiệt và dùng trong các loại thực phẩm chức năng [5]. Trước đây, COS thường được sản xuất bằng phương pháp hoá học với hiệu suất thu hồi thấp và dẫn đến nguy cơ gia tăng ô nhiễm môi trường [6]. Ngày nay, quá trình thủy phân chitin bằng chitinase (EC 3.2.1.14) để sản xuất COS đã dần thay thế phương pháp hoá học [6, 7].
Chitinase có thể thu nhận từ các nhóm sinh vật khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, thực vật [6]. Theo các công bố, vi khuẩn biển đang chiếm ưu thế bởi khả năng sinh chitinase cao, đặc hiệu so với các nguồn phân lập khác như từ đất, thực vật, nước thải [11, 12]. Trong bài báo này, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng vi khuẩn biển sinh chitinase hoạt tính cao. Trong đó, chủng vi khuẩn biển Bacillus licheniformis DS23 được nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng phân huỷ chitin tạo COS ứng dụng trong lĩnh vực y, dược phẩm.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu nước biển, mẫu tôm đang phân hủy tại Hải Thịnh-Nam Định, Đồ Sơn-Hải Phòng, Vân Đồn-Quảng Ninh, Mỹ Khê-Đà Nẵng vàđược lưu giữtrong bộsưu tập giống của Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệsinh học, Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệViệt Nam.
Môi trường nuôi cấy: Môi trường M1 (g/l): cao thịt 3,0; peptone 10,0; NaCl 10,0; agar 20,0; colloidal chitin 1,0%: 5,0 ml; nước cất 1000 ml; pH 6,5. Môi trường K1 (g/l): cao nấm men 3,0; K2HPO4 0,7; KH2PO4 0,3; MgSO4 0,5; NaCl 10,0; CaCl2 0,1; thạch 20,0; colloidal chitin 1,0%: 5,0 ml; nước cất 1000 ml; pH 6,5. Môi trường MPA (g/l): cao thịt 3,0; peptone 10,0; NaCl 10,0; thạch 20,0; nước cất 1000 ml; pH 7,0.
Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn DS23 như: hình thái, sinh lý, sinh hóa, đặc điểm nuôi cấy được thực hiện và mô tả trong khóa phân loại Bergey [4, 9].
Phương pháp tách DNA tổng số và tinh sạch sản phẩm 16S rDNA được tiến hành theo mô tả của Cissé và cộng sự (2019) [1]. Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra, tinh sạch, giải trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Cây phát sinh loài dựa trên trình tự gen 16S rDNA được xây dựng trên phần mềm MEGA 6 bằng cách sử dụng phương pháp Neighbor-Joining, dựa trên thuật toán gamma và Kimura 2 với giá trị bootstrap 1000 [2, 13].
Xác định hoạt tính chitinase: Hoạt tính chitinase được xác định theo phương pháp so màu thông qua lượng N-acetyl D-glucosamine chuyển hóa cơ chất colloidal chitin [14]. Một đơn vị hoạt tính chitinase được xác định là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μmol N-acetyl D-glucosamine trong thời gian một phút ở 37oC, pH 5,2.
Xác định phổ sản phẩm COS bằng sắc ký bản mỏng: Phổ sản phẩm chitooligosaccharides được xác định bằng phương pháp của [3]. Chitinase thô từ dịch lên men chủng DS23 được ủ với 1% colloidal chitin trong đệm kali phosphat 20 mM, pH 6,0; thời gian phản ứng từ 20-60 phút ở 45oC.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sàng lọc chủng vi khuẩn biển sinh chitinase
Từ 500 chủng vi khuẩn phân lập được, đã xác định được 12 chủng có đường kính vòng phân giải chitin >25 mm và ổn định trên môi trường thạch MPA và MS (kết quả không công bố). Các chủng được tuyển chọn kí hiệu lần lượt là: D18, 235, DS23, C21, 452, HT14, 3, 17cp, 812, 90, 112, 21. Tổng số 12 chủng vi khuẩn tiềm năng được nuôi trong môi trường lỏng M1 và K1 để xác định hoạt tính chitinase. Kết quả xác định hoạt tính chitinase từ dịch lên men của 12 chủng tiềm năng cho thấy (Bảng 1), chủng DS23 có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất, đạt 109,7±1 U/ml trên môi trường M1 và 104,7±4 U/ml trên môi trường K1. Hoạt tính chitinase từ chủng DS23 cao gấp 1,7 lần so với chủng Aeromonas hydrophila HS4 và Aeromonas punctata HS6 phân lập tại Ấn Độ [10]. Do vậy, chủng vi khuẩn DS23 được lựa chọn để tiến hành những nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 1. Hoạt tính chitinase của các chủng vi khuẩn trên hai môi trường M1 và K1
Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn DS23
Kết quảnghiên cứu môt số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng DS23 trên môi trường MPA, cho thấy chủng DS23 có mép hình răng cưa, bề mặt khuẩn lạc lồi, khô, nhăn nheo, sinh sắc tố. Quan sát qua kính hiển vi cho thấy chủng DS23 là vi khuẩn Gram (+), sinh bào tử, hình que dài, kích thước dao động từ 0,5-1,0 × 2,5-3,0 mm, có khả năng di động (Bảng 2 và Hình 1A). Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn có ý nghĩa thực tiễn cao, giúp củng cố kết quả phân loại đến loài và kiểm soát quá trình nhân giống và lên men sinh enzyme của vi khuẩn.
Chủng DS23 có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ và pH rộng (nhiệt độ 15-55oC; pH 5÷11), chịu được nồng độ muối tới 7% và có khả năng sinh tổng hợp một số enzym ngoại bào như catalase, amylase, lipase và protease. Bên cạnh đó, DS23 khả năng đồng hóa nhiều loại đường, phát triển tốt trên các môi trường có bổ sung D-cellobiose, glycogen, D-manose, D-fructose, D-lactose, D-glucose và D-trehalose nhưng không phát triển trên môi trường có D-raffinose, dulcitol, xylitol, D-arabitol, D-lyxose. So sánh đặc điểm sinh học của chủng DS23 với các đặc điểm trong khóa phân loại Bergey, cho thấy chủng DS23 có đặc điểm tương đồng với các vi khuẩn thuộc chi Bacillus [4, 9].
Bảng 2. Đặc điểm hình thái và sinh lý, sinh hoá dựa trên kit API của chủng DS23
Phân loại chủng DS23 bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA
Kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA và so sánh với các trình tự gen đã công bố trên GenBank bằng công cụ BLAST (NCBI) cho thấy, gen 16S rDNA của chủng DS23 có độ tương đồng cao (>99%) với gen tương ứng của chủng vi khuẩn B. licheniformis DSM (mã số NR118996.1). Trình tự gen 16S rDNA của chủng DS23 đã được đăng ký trên GenBank với mã số GU004539. Dựa vào kết quả so sánh về độ tương đồng khi so với cơ sở dữ liệu GenBank, cây phát sinh chủng loại (Hình 1B), kết hợp với đặc điểm hình thái, sinh hóa (Bảng 2) chủng vi khuẩn DS23 thuộc loài Bacillus licheniformis và được đặt tên là B. licheniformis DS23.
Hình 1. Hình thái tế bào (A) và cây phát sinh (B) được dựng theo phương pháp Neighbor-Joining dựa trên các trình tự gen 16S rDNA biểu diễn mối liên hệ giữa chủng B. licheniformis DS23 và các chủng vi khuẩn đại diện. Bootstrap = 1000 lần lặp; Bar = 0,05 đại diện cho sự thay thế cho mỗi nucleotide.
Theo các công bố trước đây, B. licheniformis là nhóm vi khuẩn khá phổ biến trong tự nhiên, thường được phân lập từ đất, nước biển, nước thải, thực phẩm… Vi khuẩn này có khả năng chống chịu với điều kiện môi trường khắc nghiệt và sinh protease kiềm cao nên được sử dụng trong sản xuất công nghiệp chế biến thuộc da và xử lý nước thải [11, 12]. Trên thế giới, vi khuẩn biển thuộc loài B. licheniformis được công bố nhiều về khả năng sinh chitinase do ái lực cao với cơ chất chitin có nguồn gốc từ vỏ tôm [12].
Hình 2. Phổ sản phẩm sau quá trình thủy phân colloidal chitin từ dịch lên men chủng B. licheniformis DS23. Băng1: N-acetyl D-glucosamine; Băng 2: COS chuẩn (FASOS, Kitto Life, Hàn Quốc); Băng 3, 4 và 5: Sản phẩm quá trình thủy phân colloidal chitin sau 20, 40 và 60 phút.
Đánh giá khả năng phân huỷ colloidal chitin
Khả năng phân huỷ chitin tạo COS là tiêu chí quan trọng để tạo đánh giá tiềm năng ứng dụng của chitinase thu nhận từ chủng vi khuẩn biển B. licheniformis DS23. Phản ứng thuỷ phân colloidal chitin sau 20-60 phút cho thấy, chitinase thô từ dịch lên men chủng DS23 hoạt động hiệu quả trong quá trình phân cắt colloidal chitin và lượng COS tạo ra tăng dần theo thời gian phản ứng. Sản phẩm tạo thành bao gồm (GlcNAc)2 (chitobiose), (GlcNAc)3 (chitotriose), (GlcNAc)4 (chitotetraose), (GlcNAc)5 (chitopentose) và (GlcNAc)6 (chitohexose). Trong đó, chitobiose chiếm tỷ lệ cao cao nhất. Sau 40 và 60 phút, lượng COS có phân tử lượng thấp như chitobiose và chitotriose có xu hướng tăng lên do các phân tử chitopentose và chitohexose bị phân cắt tạo thành các COS có kích thước nhỏ hơn. Endochitinase từ chủng B. licheniformis DSM8785 và Paenicibacillus barengoltzii phân huỷ colloidal chitin tới chitobiose ở khoảng pH 5,5-6,0 và nhiệt độ 50-550C [11, 15]. Do đó, chitinase từ chủng B. licheniformis DS23 nhiều khả năng thuộc nhóm endochitinase, nhóm enzyme có nhiều tiềm năng ứng dụng nhất trong lĩnh vực y dược và thực phẩm chức năng.
4. KẾT LUẬN
Từ các mẫu nước biển, tôm phân huỷ tại các tỉnh ven biển Việt Nam đã phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn DS23 thể hiện hoạt tính chitinase cao. Kết quả nghiên cứu phân loại dựa trên đặt điểm hình thái và sinh học kết hợp với kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA, chủng DS23 được định danh là B. licheniformis DS23 (mã số GenBank GU004539). Chủng B. licheniformis DS23 có khả năng sinh trưởng trong phổ nhiệt độ và pH rộng; có hệ enzym ngoại bào phong phú (catalase, amylase, lipase, protease và chitinase). Chitinase xúc tác phản ứng chuyển hóa colloidal chitin tạo ra phổ sản phẩm COS gồm các oligomer chitobiose, chitotriose, chitotetraose, chitopentose, chitohexose. Do vậy, chủng B. licheniformis DS23 có tiềm năng trong sản xuất COS sử dụng làm nguyên liệu thuốc và thực phẩm chức năng.
Lời cảm ơn
Công trình được thực hiện nhờ kinh phí của đề tài mã số ĐT.08-10/CNSHCB cấp Bộ Công Thương và hỗ trợ máy móc thiết bị thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Cissé, H., et al. (2019), Molecular characterization of Bacillus, lactic acid bacteria and yeast as potential probiotic isolated from fermented food. Scientific Asian 6: e00175.
2. Felsenstein, J.J.E. (1985), Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39(4): 783-791.
3. Fu, X., et al. (2014), An acidic, thermostable exochitinase with β-N-acetylglucosaminidase activity from Paenibacillus barengoltzii converting chitin to N-acetyl glucosamine. Biotechnology for Biofuels 7(1): 174.
4. Garrity G.M. and H.J.G. (2001), The road map to the manual, In Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2001, Springer: New York. p. 119-166.
5. Han, Y., et al. (2008), Statistical optimization of medium components to improve the chitinase activity of Streptomyces sp. Da11 associated with the South China Sea sponge Craniella australiensis. Process Biochem 43(10): 1088-1093.
6. Park, S.H., J.H. Lee and H.K.J.J. (2000), Purification and characterization of chitinase from a marine bacterium, Vibrio sp. 98CJ11027. The Journal of Microbiology 38(4): 224-229.
7. Patil, R.S., et al. (2000), Chitinolytic enzymes: an exploration. Enzyme and Microbial Technology 26(7): 473-483.
8. Phạm Thị Đan Phượng và cs. (2014), Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản. Tập 2: Tr. 37-43.
9. Sambrook J. and R. D.W. (2001), Molecular cloning, In A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor: New York.
10. Saima, M.K. and Roohi, I.Z.A. (2013), Isolation of novel chitinolytic bacteria and production optimization of extracellular chitinase. 11: 39-46.
11. Songsiriritthigul, C., et al. (2010), Expression and characterization of Bacillus licheniformis chitinase (ChiA), suitable for bioconversion of chitin waste. Bioresource Technology 101(11): 4096-4103.
12. Songsiriritthigul, C., et al. (2009), Directed evolution of a Bacillus chitinase. Biotechnol J 4(4): 501-509.
13. Tamura, K., et al. (2013), MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30(12): 2725-2729.
14. Thamthiankul, S., et al. (2001), Chitinase from Bacillus thuringiensis subsp. pakistani. Applied Microbiology and Biotechnology 56(3-4): 395-401.
15. Yang, S., et al. (2016), Cloning, expression, purification and application of a novel chitinase from a thermophilic marine bacterium Paenibacillus barengoltzii. Food Chemistry 192: 1041-1048.
Quách Ngọc Tùng, Nguyễn Văn Hiếu, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Bùi Thị Liên, Nguyễn Văn Thế, Phí Quyết Tiến
Viện Công nghệ sinh học (IBT), Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST)
Theo Bản tin KHCN ngành Công Thương số 6 năm 2020
Đăng nhập
