TÓM TẮT:
Các sản phẩm thực phẩm chức năng quân dụng giúp binh sỹ nâng cao thể lực, tăng cường khả năng tác chiến có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong điều kiện chiến tranh hiện đại. Với những tác dụng rõ rệt được chứng minh bằng khoa học và thực tế sử dụng sản phẩm natto tại Nhật Bản, vi khuẩn B. subtilis var natto và enzyme Nattokinase là nguyên liệu được sử dụng để sản xuất thực phẩm chức năng bổ dưỡng cho não, sử dụng để nâng cao khả năng hoạt động trí não của bộ đội trong điều kiện tác chiến đặc biệt cũng như bảo vệ sức khỏe, giảm nguy cơ hình thành máu đông. Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố như nồng độ oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis var natto là 50%, hệ số cô đặc bằng màng lọc tiếp tuyến 10kDa trong quá trình thu nhận dịch chứa Nattokinase là 2,5 lần thì đạt độ tinh sạch 87,7%. Lựa chọn được các thông số sấy phun để thu bột chế phẩm Nattokinase là nhiệt độ đầu vào 110oC, tốc độ phun sương 15 mL/h. Từ đó hoàn thiện được quy trình thu nhận chế phẩm bột Nattokinase có hoạt tính 527 FU/g sử dụng làm nguyên liệu sản xuất viên nang SuTab Spobio SOB sử dụng cho bộ đội làm việc nhiệm vụ đặc biệt.
1. MỞ ĐẦU
Nattokinase là một hoạt chất sản sinh trong quá trình lên men tự nhiên được chứng minh là có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng bệnh tắc huyết khối và nhồi máu cơ tim. Ngoài tác dụng tiêu hủy huyết khối, Nattokinase còn có tác dụng ngăn ngừa hình thành cục máu đông, giảm độ nhớt máu, tăng cường lưu thông máu, phục hồi các vùng não và cải thiện di chứng sau tai biến mạch máu não. Đặc biệt, Nattokinase không gây ra các biến chứng chảy máu trong như khi dùng các thuốc kháng đông và tiêu huyết khối thông thường do cơ chế là trực tiếp phân cắt fibrin trong huyết khối và gián tiếp bằng cách hoạt hoá sự sản xuất urokinase và plasmin. Theo nghiên cứu của Kim JK và cộng sự trên 73 bệnh nhân (có huyết áp tâm thu từ 130 đến 159 mmHg), sau 8 tuần sử dụng Nattokinase 2000 FU/ 1 ngày, kết quả rất khả quan thu được là huyết áp tâm thu giảm 5,55mg Hg và huyết áp tâm trương giảm 2,84 mmHg).
Tại Việt Nam cũng như trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu, tối ưu hóa quá trình thu nhận chế phẩm enzyme Nattokinase có hoạt tính cao để làm TPCN. Năm 2012, Lê Thị Bích Phượng và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn một số chủng B. subtilis sinh tổng hợp Nattokianase. Enzyme Nattokinase thu được có hoạt độ 470 FU/g, chiếm khoảng 70- 85% so với hoạt tính protease tổng. Sản phẩm TPCN có chứa Nattokinase trên thị trường có thể kể đến là Nattopes (IMC) và Hoạt huyết vina (Sao Thái Dương) được sản xuất từ nguồn nguyên liệu trong nước và nhập từ Đài Loan.
Trong các nghiên cứu trước của nhóm đề tài thực hiện, đã tiến hành tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp Nattokinase từ vi khuẩn Bacillus subtilis var natto. Kết quả cho thấy trong môi trường LB bổ sung khô đậu tương; 1,5% glucose; 1,36% pepton; pH =7,76; nhiệt độ 37oC; thời gian lên men 24h cho hoạt lực Nattokinase đạt 80,40 FU/ml.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục khảo sát một số điều kiện để thu nhận bột chế phẩm Nattokinase, ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng dưỡng não SUTAB SOB sử dụng cho bộ đội hoạt động trong điều kiện đặc biệt.
2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu và hóa chất
Chủng B. subtilis var Natto ANA 14 được nuôi cấy và bảo quản bởi công ty ANABIO R&D, và bào tử ở dạng nguyên liệu đạt nồng độ đậm đặc của bào tử sống lên tới > 2 x 1011 CFU/g và các chỉ tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm.
Các hoá chất cồn ethanol, K2HPO4, KH2PO4, CH3COONa pha đệm, đường Maltodextrin, pepton, cao nấm men, glucose,… và một số hóa chất khác của hãng Sigma (Mỹ), Mecrk (Đức), Thermo Scientific (Đức)...
2.2. Thiết bị
Thiết bị chính: hệ thống lọc tiếp tuyến AKTA flux của hãng GE Healthcare (Úc), hệ thống gia nhiệt có cánh khuấy dung tích 100L (Đức), hệ thống sấy phun APS Anhydro A/S (Đan Mạch), máy vắt ly tâm 20L/mẻ (Việt Nam).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oxy
Tiến hành sục khí vào nồi lên men với tốc độ khí sục là 1L/ phút, hàm lượng oxy hòa tan được máy duy trì tự động bằng cách thay đổi tốc độ khuấy. Mẫu được nuôi ở các DO khác nhau 10, 30, 50, 70%. Nồng độ oxy được đo bằng thiết bị Máy đo DO để bàn cơ bản Hanna HI2400. Ảnh hưởng của nồng độ oxy đến quá trình được xác định thông qua chỉ tiêu tổng số tế bào của vi khuẩn. (Bảng 1).
2.3.2. Phương pháp đo mật độ tế bào
Mẫu được pha loãng liên tiếp 10 lần và cấy trải trên môi trường thạch LB 1X. Đĩa thạch được ủ ở 37oC 12h. Tổng số tế bào của mẫu bằng số khuẩn lạc nhân với hệ số pha loãng. Độ sống của bào tử được xác định tương tự như tổng số tế bào nhưng mẫu được xử lý nhiệt ở 80oC trong 20 phút trước khi pha loãng.
2.3.3. Khảo sát tinh sạch nattokinase bằng phương pháp siêu lọc
Các thông số công nghệ được lựa chọn bao gồm: pH của dịch trích 5, màng lọc 50 kDa, áp suất vận hành 6 bar, nhiệt độ phòng, diện tích màng lọc 0,144m2 (các thông số này được xây dựng dựa vào kích thước phân tử và tính chất của nattokinase). Hệ số cô đặc và số lần bổ sung nước vào dòng nhập liệu sẽ được lần lượt thay đổi để nâng cao hiệu quả tinh sạch protein. Quá trình được thực hiện ở quy mô pilot. Các thông số khảo sát: hệ số cô đặc (1,0-1,5-2,0-2,5), số lần bổ sung nước vào dòng nhập liệu (1-2-3-4-5). Hiệu quả quá trình tinh sạch được đánh giá dựa trên hiệu suất thu hồi protein và hoạt tính nattokinase .
Bảng 1. Kết quả khảo sát nồng độ oxy hòa tan đến tổng số tế bào của Bacillus subtilis var Natto
Hình 1. Hệ số cô đặc
2.3.4. Sấy phun tạo bột Nattokinase
Dịch cô đặc chứa Nattokinase được trộn với chất mang (Maltodextrin) với tỷ lệ 5% để sấy phun ở nhiệt độ đầu vào 105-110oC, nhiệt độ đầu ra 55-60oC, tốc độ atomizer 10.000- 15.000 rpm, tốc độ phun sương 5-20 mL/phút.
2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính Nattokinase
Phương pháp được tiến hành theo Phạm Thị Quỳnh và cộng sự, 2014.
3. KẾT QUẢ
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oxy
Tiến hành sục khí vào nồi lên men với tốc độ khí sục là 1L/ phút, hàm lượng oxy hòa tan được máy duy trì tự động bằng cách thay đổi tốc độ khuấy. Mẫu được nuôi ở các DO khác nhau 10, 30, 50, 70%. Kết quả được thể hiện ở bảng dưới. Mật độ tế bào đạt được cực đại 1,8 x 109 ở DO 50%. Kết luận DO 50% là nồng độ oxy hòa tan phát triển tối ưu của B. subtilis var Natto và sinh tổng hợp enzyme Nattokinase có hoạt tính cao. DO 50% được sử dụng trong thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lọc màng
Theo kết quả trình bày ở Hình 1, với hệ số cô đặc là 2,5, hiệu suất thu hồi protein đạt trên 95%. Dịch chiết ban đầu có độ tinh sạch của protein là 77%. Khi thực hiện siêu lọc đến hệ số cô đặc thể tích là 2,5 thì độ tinh sạch đạt 87,8%, tỷ lệ loại bỏ phytate và carbohydrate lần lượt là 30,58 và 56,76%.
Dịch protein được cô đặc đến hệ số cô đặc là 2,5 lần. Dòng không qua màng sẽ được bổ sung thêm nước để đạt thể tích như dịch trích protein ban đầu rồi hiệu chỉnh đến pH 5 và tiếp tục thực hiện quá trình siêu lọc để làm tăng hiệu quả tinh sạch protein
3.3. Sấy phun tạo bột Nattokinase
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ khí vào
Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 2
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong quá trình sấy phun. Nhiệt độ khí đầu vào không chỉ ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình sấy mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm được thu thập sau khi sấy, ví dụ: độ ẩm, độ hòa tan, kích thước hạt, mật độ tế bào. Dựa vào kết quả thực nghiệm trình bày ở Bảng 2, lựa chọn nhiệt độ đầu vào là 110oC.
Bảng 2. Khảo sát nhiệt độ sấy phun
Bảng 3. Khảo sát tốc độ nhập liệu
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nhập liệu
Tốc độ nhập liệu trong quá trình sấy phun là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm và hiệu suất quá trình sấy. Dựa vào các kết quả thực nghiệm được trình bày ở Bảng 3, lựa chọn tốc độ nhập liệu cho quá trình sấy phun tạo chế phẩm nattokinase là 15mL/h. Sinh khối bào tử vi khuẩn B. subtilis var Natto và dịch chứa Nattokinase sau khi lọc cô đặc 2,5 lần được đem đi trộn với chất mang (maltodextrin) với tỷ lệ 5% rồi được sấy khô nhờ thiết bị sấy phun ở nhiệt độ đầu vào 110oC, nhiệt độ đầu ra 55oC, tốc độ atomizer 10.000 rpm, tốc độ phun sương 15 mL/h. Đóng gói bột chứa Nattokinase và bào tử vi khuẩn trong túi kẽm hàn kín và hút chân không bằng thiết bị hút chân không, bảo quản ở 4oC. Từ 1 mẻ lên men 200L, chúng tôi thu được khoảng 600 g bột bào tử vi khuẩn đạt nồng độ 4 x 1011CFU/g và khoảng 500g bột Nattokinase có hoạt độ 527 FU/g bột. Hai bột nguyên liệu này đạt tiêu chuẩn để làm nguyên liệu cho sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khoẻ SUTAB-SOB. Sơ đồ quy trình tạo chế phẩm protease giàu Natokinase và sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis var natto được trình bày ở Hình 2.
Hình 2. Quy trình tạo chế phẩm protease giàu Natokinase và sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis var natto
4. KẾT LUẬN
Đã khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố như nồng độ oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis var natto là 50%, hệ số cô đặc bằng màng lọc tiếp tuyến 10kDa trong quá trình thu nhận dịch chứa Nattokinase là 2,5 lần.
Lựa chọn được các thông số sấy phun để thu bột chế phẩm Nattokinase là nhiệt độ đầu vào 110oC, tốc độ phun sương 15 mL/h. Từ đó hoàn thiện được quy trình thu nhận chế phẩm bột Nattokinase có hoạt tính 527 FU/g.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Duc le H, Hong HA, Barbosa TM, et al. (2004) Characterizationof Bacillus probiotics available forhuman use. Appl Environ Microbiol 70, 2161–2171.
2. Gabriella, C. and Cutting S., (2002), Bacillus Probiotic: Spore Germination in the Gastrointestinal Tract. Appl Environ Microbiol 68(5): 2344–2352.
3. Green DH, Wakeley PR, Page A, Barnes A,Baccigalupi L, Ricca E, and Cutting SM. (1999) Characterizationof two Bacillus probiotics. Appl. Environ.Microbiol. 65, 4288-4291.
4. Kim JY(2008),” Effects of nattokinase on blood pressure: a randomized, controlled trial”, Hypertension Research (2008) 31, 1583–1588.
5. Lê Thị Bích Phượng (2012), “Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase”. Tạp chí sinh học, 2012, 34 (3 SE): 99-104.
6. Phạm Thị Quỳnh (2014), “Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp nattokinase theo phương pháp lên men chìm ở quy mô phòng thí nghiệm”, Luận văn thạc sỹ kỹ thuật, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
Nguyễn Hà Trung1, Nguyễn Thị Vân Anh2, Lê Huy Hoàng1, Phạm Kiên Cường1
1Viện Công nghệ mơi/ Viện KH-CNQS
2Trường Đại học Khoa học Tự nhiên/ Đại học Quốc gia Hà Nội
Theo Bản tin KHCN ngành Công Thương số 6 năm 2020
Đăng nhập
