TÓM TẮT
Nấm Vân chi (Trametes vercsicolor) là nấm dược liệu được sử dụng phổ biến để sinh tổng hợp Polysaccharopeptide (PSP), một chất có hoạt tính sinh học quý giá. Nghiên cứu này tập trung tối ưu hoá thành phần môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường khả năng sinh tổng hợp PSP của nấm Vân chi trong môi trường lỏng. Kết quả nghiên cứu chỉ ra dextrin và pepton là hai nguồn cacbon và nitơ quan trọng cho nấm Vân chi sinh tổng hợp PSP. Quá trình tối ưu hoá sử dụng phương pháp tối ưu hoá bề mặt cho kết quả hàm lượng PSP đạt 0,3 g/L tăng 1,2 lần trước khi tối ưu hoá khi sử dụng hàm lượng dextrin và pepton lần lượt là 59,6 g/L và 6,5 g/L. Các nghiên cứu bước đầu về hoạt tính sinh học cũng chỉ ra rằng PSP trong nghiên cứu này có khả gây độc lên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với IC50 là 0,78 mg/ml.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ.
Trametes versicolor có tên tiếng Việt là nấm Vân chi, một chủng nấm dược liệu đã được nghiên cứu và ứng dụng từ lâu trong dược phẩm với các tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư. Một trong những hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng được chiết xuất từ sinh khối của chủng nấm là Polysaccharopeptide (PSP), có thành phần cấu tạo gồm chuỗi polysaccharide và chuỗi peptide. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng PSP giúp cải thiện đáng kể chất lượng cuộc sống, giúp giảm đau và tăng cường tình trạng miễn dịch ở 70-97% bệnh nhân mắc ung thư dạ dày, thực quản, phổi, buồng trứng, cổ tử cung... [1, 2]. Các tác dụng phụ gây ra bởi khối u và do quá trình điều trị ung thư bằng hóa trị , xạ trị cũng được giảm nhẹ khi sử dụng PSP hỗ trợ cùng [3]. Polysaccharopeptide từ nấm Vân chỉ có thể được chiết từ quả thể nấm hoặc sợi nấm. Tuy nhiên việc nuôi trồng quả thể nấm Vân chi có nhược điểm là tốn nhiều thời gian, chất lượng nấm không ổn định, phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết, dịch hại, dễ bị nhiễm tạp. Phương pháp lên men chìm có thể khắc phục được những hạn chế của việc thu polysaccharopeptide từ quả thể nấm, vì vậy nó dường như là một sự thay thế đầy hứa hẹn cho sản xuất PSP [4].
Trong môi trường nuôi cấy chìm, tốc độ tăng trưởng sợi nấm, khả năng tích lũy PSP thay đổi theo thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, cụ thể là nguồn carbon và nitơ, pH,...[5]. Mục đích của nghiên cứu này là tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên chìm để thu hồi PSP của nấm Vân chi. Bên cạnh đó nghiên cứu cũng tiến hành khảo sát hoạt tính sinh học quan trọng của PSP tác động trên dòng tế bào ung thư vú (MCF-7).
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Chủng nấm Vân chi Trametes versicolor BRG04 được cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Chủng nấm được giữ trên môi trường PDA tại 40C. Nấm được hoạt hoá trên môi trường lỏng TaK ( glucose 10 g/L; cao malt (malt extract) 3 g/L; pepton 2 g/L; cao nấm men (yeast extract) 2 g/L; asparagine 1 g/L; KH2PO4 2 g/L; MgSO4.7H2O 1g/L; thiamine 1 mg/L) [6], tốc độ lắc 120 rpm, nhiệt độ 25oC; sau 5 ngày sinh khối nấm được thu nhận bằng cách ly tâm tại 6000xg 10 phút, đồng hoá sử dụng máy đồng hoá cầm tay IKA và được sử dụng để cấp vào các môi trường nuôi cấy lỏng.
2.2. Xác định sinh khối nấm và PSP
Sinh khối được thu sau quá trình lên men bằng phương pháp lọc, rửa 3 lần với nước cất, sấy khô đến khối lượng không đổi ở 500C, 48h. Để thu nhận PSP thô, sinh khối khô được chiết với nước theo tỷ lệ 1g/30 mL tại 121oC, 1 giờ. Dịch chiết sinh khối được kết tủa với cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 1:4, để kết tủa qua đêm ở 4oC, ly tâm thu tủa 8000xg, 30 phút. Kết tủa được rửa với cồn 70 v/v, sau đó được sấy khô ở 45oC, 24h để thu PSP thô [3, 7]. Hàm lượng polysaccharide trong PSP được định lượng bằng phương pháp sulfuric phenol [8]. Hàm lượng protein trong PSP được định lượng bằng phương pháp Bradford [9]. Khối lượng PSP được xác định bằng tổng hàm lượng polysaccharide và peptit [10].
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Nấm Vân chi được nuôi trong môi trường lên men lỏng bao gồm glucose 30 g/L, pepton 4 g/L, MgSO4 0,5 g/L, KH2PO4 1 g/L, pH 7 [11] được chuẩn bị trong các bình khía 250 mL chứa 50 mLL môi trường, chủng giống được cấp vào với tỷ lệ 0,1% (w/v) và lắc ở 120 rpm, 25oC. Sau 7 ngày lên men sinh khối nấm được thu hồi và phân tích.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh khối nấm và PSP: Nguồn glucose 30 g/L trong môi trường lỏng được thay thế lần lượt bằng các nguồn chất chiết malt, đường saccharose và dextrin.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh khối nấm và PSP: Nguồn pepton 4 g/L được thay thế lần lượt bằng NH4NO3; (NH4)2SO4; NaNO3; cao nấm men
Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy
Phương pháp tối ưu hoá bề mặt sử dụng ma trận tâm xoay (CCD) được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dextrin và pepton tới khả năng sinh tổng hợp sinh khối và PSP của nấm Vân chi, biến thiên nồng độ được thể hiện trên Bảng 1. Kết quả thu nhận được phân tích bằng phần mềm Design Expert 11.
Bảng 1: Các yếu tố độc lập và mức mã hóa tương ứng
Hoạt tính kháng tế bào ung thư
Xét nghiệm độc tính tế bào đối với dòng tế bào khối u vú MFC-7 theo phương pháp MTT được báo cáo bởi Campling và cộng sự [12], nghiên cứu này được thực hiện tại Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Cacbon là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển cũng như sinh tổng hợp các chất của nấm [13]. Trong nghiên cứu này nguồn glucose được thay thế bằng các nguồn chiết malt, đường saccharose hoặc dextrin nhằm đánh giá ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh trưởng và sinh tổng hợp PSP của chủng nấm Vân chi (Hình 1).
Hình 1: Nguồn cacbon ảnh hưởng đến sinh khối và PSP
Kết quả trên Hình 1 chỉ ra khi thay glucose bằng cao chiết malt, saccharose hoặc dextrin làm tăng lượng sinh khối nấm Vân chi từ 1,1 đến 1,3 lần. Theo nghiên cứu của Bolla [14], cao malt là nguồn caccbon hiệu quả cho sự tăng trưởng sợi nấm, tuy nhiên trong nghiên cứu này dextrin cho hàm lượng sinh khối cao nhất đạt 9,03 g/L sinh khối khô. Tương tự như kết quả sinh khối, hàm lượng PSP thu nhận được cũng tăng dần 1,14 lần đến 1,7 lần khi thay glucose bởi chất chiết malt, đường saccharose hoặc dextrin. Hàm lượng PSP đạt cao nhất 0,25 g/L khi sử dụng dextrin là nguồn cacbon thay thế cho glucose.
3.2. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ
Nguồn nitơ cũng là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm sợi. Trong nghiên cứu này, ba nguồn nitơ vô cơ, hai nguồn nitơ hữu cơ được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các nguồn này tới khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp PSP của nấm Vân chi (Hình 2)
Hình 2: Nguồn nitơ ảnh hưởng đến sinh khối và PSP
Trong số 05 nguồn nitơ được khảo sát, cao nấm men và pepton là hai nguồn nitơ cho năng suất sinh khối tương ứng đạt 9,49 và 9,09 g/L, cao hơn nhiều so với các nguồn nitơ vô cơ được sử dụng. Trong đó cao nấm men là nguồn nitơ phù hợp nhất để phát triển sinh khối. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Wang [11] khi tác giả cũng chỉ ra rằng cao nấm men là hiệu quả nhất để tăng sinh khối của nấm Vân chi.
Kết quả phân tích hàm lượng PSP thu nhận chỉ ra rằng, mặc dù cao nấm men là nguồn nitơ thích hợp nhất cho nấm Vân chi phát triển sinh khối nhưng nguồn nitơ pepton mới cho khả năng sinh tổng hợp PSP cao nhất. Hàm lượng tích luỹ của PSP khi sử dụng pepton đạt 27,76 mg/g sinh khối trong khi đó nguồn cao nấm men cho hàm lượng PSP tích luỹ chỉ đạt 22,58 mg/g sinh khối. Khả năng tích luỹ PSP cao khi sử dụng pepton làm cho tổng hàm lượng PSP thu nhận được đạt 0,25 g/L cao gấp 1,19 lần khi sử dụng nguồn cao nấm men.
3.3. Tối ưu hóa điều kiện môi trường
Các nghiên cứu trên chỉ ra rằng dextrin và pepton là hai yếu tố ảnh hưởng quan trọng tới khả năng sinh tổng hợp sinh khối và PSP của chủng nấm Vân chi, trong nghiên cứu này phương pháp tối ưu hoá bề mặt sử dụng ma trận tâm xoay được sử dụng để tối ưu hoá hàm lượng dextrin và pepton. Tổng số 10 thí nghiệm với hàm lượng khác nhau của dextrin và pepton được thực hiện, hàm lượng sinh khối và PSP thu nhận được được phân tích bởi phần mềm Designe Expert 11 (Bảng 2).
Ảnh hưởng của hàm lượng dextrin và pepton tới sinh khối nấm
Kết quả phân tích ANOVA cho ảnh hưởng của dextrin và pepton tới sinh khối nấm có giá trị R2 và R2 hiệu chỉnh bằng 0,94 và 0,89 cho thấy mối tương quan tương đối chặt chẽ giữa giá trị sinh khối xác định được trong thực tế và giá trị sinh khối tính toán theo mô hình. Phương trình biểu diễn mỗi quan hệ giữa hàm lượng dextrin (A) và pepton (B) sử dụng tới lượng sinh khối, sau khi loại bỏ các giá trị không có ý nghĩa, có dạng (công thức 1), và được biểu diễn dưới dạng đồ thị (Hình 3).
Bảng 2: Ma trận thực nghiệm và kết quả thu nhận
Sinh khối (g/L) = - 5,252 + 0,414*A - 0,0035*A2 - 0,163*B2 (1)
Kết quả phân tích chỉ ra rằng, trong hai thành phần môi trường sử dụng, dextrin có ảnh hưởng tới sinh khối của nấm Vân chi cao hơn so với ảnh hưởng của pepton. Khi lượng dextrin tăng từ 10 đến 50 g/L hàm lượng sinh khối sinh tổng hợp tăng dần, tuy nhiên khi tiếp tục tăng hàm lượng dextrin từ 50 -70 g/L thì lượng sinh khối bắt đầu giảm.
Ảnh hưởng của dextrin và pepton đến PSP sinh tổng hợp
Phân tích ANOVA cho sự ảnh hưởng của nồng độ dextrin và pepton đến khả năng sinh tổng hợp PSP cho kết quả R2 và R2 hiệu chỉnh lần lượt là 0,96 và 0,93; các giá trị này cho thấy sự liên kết chặt chẽ giữa dữ liệu thử nghiệm và các giá trị dự đoán. Vì vậy, mô hình này có thể sử dụng để dự đoán cho ảnh hưởng của dextrin và pepton đến hàm lượng PSP được sinh tổng hợp (công thức 2).
Hàm lượng PSP (g/L) = - 0,117 + 0,006*A + 0,071*B – 0,00005*A2 – 0,0054*B2 (2)
Kết quả thu nhận chỉ ra trong hai yếu tố nguồn dextrin và nguồn pepton thì pepton là yếu tố ảnh hưởng quan trọng hơn tới lượng PSP thu nhận được. Khi tăng pepton từ 2 đến 6,5 g/L thì hàm lượng PSP thu nhận tăng dần, và tiếp đó giảm dần khi lượng pepton tăng từ 6,5 đến 10 g/L. Ảnh hưởng của dextrin tới PSP cũng như tương tự như ảnh hưởng tới sinh khối (Hình 3)
Tối ưu hóa cho hàm lượng PSP sinh tổng
Kết quả phân tích bằng phần mềm cho thấy điều kiện tối ưu cho hàm lượng PSP 0,3 g/L thu nhận là 59,6 g/L và 6,5 g/L tương ứng với nồng độ dextrin và pepton và điểm tối ưu hoá sinh khối không trùng khớp với điểm tối ưu hoá cho thu nhận PSP. Điều kiện tối ưu đã được kiểm chứng hàm lượng PSP thu được thực tế tăng 1,2 lần so với môi trường chưa tối ưu.
3.5. Hoạt tính sinh học của PSP
Hoạt tính sinh học của PSP thô được thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư vú MFC-7. Kết quả phân tích chỉ ra PSP có tỷ lệ ức chế dòng tế bào MFC-7 là 53,28 ± 2,0 (%) tại nồng độ 1 mg/ml và IC50 của PSP thô là 0,78 mg/ml. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra chiết xuất polysaccharopeptide từ nấm Vân chi có thể ức chế chọn lọc các dòng tế bào ung thư vú: T47D, Bcap37, ZR75-30, MCF-7 [15]. Một nghiên cứu trước đó chỉ ra rằng polysaccharopeptide từ nấm Vân chi có khả năng ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ở nồng độ IC50 0,272 mg/ml [16].
IV. KẾT LUẬN
Dextrin và pepton là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp sinh khối và PSP của nấm Vân chi. Quá trình tối ưu hoá chỉ ra rằng tại điều kiện của môi trường nuôi cấy chứa 59,6 g/L dextrin; 6,5 g/L pepton cho lượng PSP thu nhận cao nhất đạt 0,3 g/L tăng 1,2 lần so với môi trường chưa tối ưu. PSP được sản xuất từ chủng nấm bằng phương pháp lên men chìm có hoạt tính gây độc trên tế bào ung thư vú dòng MCF-7 với IC50 0,78 mg/ml
Hình 3: Ảnh hưởng của dextrin và pepton đến sinh khối nấm và PSP
Lời cảm ơn
Bài báo được hoàn thành với sự tài trợ kinh phí của Bộ Công Thương theo đề tài mã số ĐT.04.18/CNSHCB. Các tác giả cũng xin được cảm ơn Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học – Công nghệ Việt Nam đã phối hợp thực hiện nghiên cứu này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Kidd, P.M., The use of mushroom glucans and proteoglycans in cancer treatment. Altern Med Rev, 2000. 5(1): p. 4-27.
2. Ng, T.B., A review of research on the protein-bound polysaccharide (polysaccharopeptide, PSP) from the mushroom Coriolus versicolor (Basidiomycetes: Polyporaceae). Gen Pharmacol, 1998. 30(1): p. 1-4.
3. Cui, J. and Y. Chisti, Polysaccharopeptides of Coriolus versicolor: physiological activity, uses, and production. Biotechnol Adv, 2003. 21(2): p. 109-22.
4. Huang, H.-C. and Y.-C. Liu, Enhancement of polysaccharide production by optimization of culture conditions in shake flask submerged cultivation of Grifola umbellata. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers, 2008. 39(4): p. 307-311.
5. Papagianni, M., Fungal morphology and metabolite production in submerged mycelial processes. Biotechnology Advances, 2004. 22(3): p. 189-259.
6. Tavares, A., et al., Selection and Optimization of Culture Medium for Exopolysaccharide Production by Coriolus (Trametes) Versicolor. Vol. 21. 2005. 1499-1507.
7. Rau, U., et al., Production and structural analysis of the polysaccharide secreted by Trametes (Coriolus) versicolor ATCC 200801. Appl Microbiol Biotechnol, 2009. 81(5): p. 827-37.
8. Dubois, M., et al., A colorimetric method for the determination of sugars. Nature, 1951. 168(4265): p. 167.
9. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976. 72(1): p. 248-254.
10. Jeong, S.C., et al., Characteristics of anti-complementary biopolymer extracted from Coriolus versicolor. Carbohydrate Polymers, 2004. 55(3): p. 255-263.
11. Wang, F., Optimization of Submerged Culture Conditions for Mycelial Growth and Extracellular Polysaccharide Production by Coriolus versiolor. Journal of Bioprocessing & Biotechniques, 2012. 02.
12. Campling, B.G., et al., Chemosensitivity testing of small cell lung cancer using the MTT assay. Br J Cancer, 1991. 63(1): p. 75-83.
13. Cui, M.-l., H.-y. Yang, and G.-q. He, Submerged fermentation production and characterization of intracellular triterpenoids from Ganoderma lucidum using HPLC-ESI-MS. Journal of Zhejiang University. Science. B, 2015. 16(12): p. 998-1010.
14. Bolla, K., et al., Optimization of carbon and nitrogen sources of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by Trametes …. International Journal for Biotechnology and Molecular Biology Research, 2010. 1: p. 15-21.
15. Zhou, X., et al., Cytotoxic activities of Coriolus versicolor (Yunzhi) extracts on human liver cancer and breast cancer cell line. Vol. 6. 2007.
16. Ho, C.Y., et al., Differential anti-tumor activity of coriolus versicolor (Yunzhi) extract through p53- and/or Bcl-2-dependent apoptotic pathway in human breast cancer cells. Cancer Biol Ther, 2005. 4(6): p. 638-44.
Trần Thị Hương - Lê Thị Mỹ Huyền - Tô Kim Anh - Phạm Tuấn Anh
Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường ĐH Bách khoa Hà Nội
Theo Bản tin KHCN ngành Công Thương số 6 năm 2020
Đăng nhập
