Thứ ba, 04/08/2020 | 16:05

Thứ ba, 04/08/2020 | 16:05

Bài báo khoa học

Cập nhật 07:50 ngày 29/07/2020

Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến sự phát triển sinh khối nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus)

TÓM TẮT: 
Nấm Thượng hoàng sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên chậm và hiếm do nấm thích nghi với vùng khí hậu lạnh và phần lớn sống trên thân gỗ dâu tằm. Do đó việc nuôi trồng nấm nhân tạo rất cần thiết để đáp ứng cho nhu cầu của con người. Việc nuôi nấm ở dạng lên men chìm đã được nghiên cứu cho hiệu quả cao do rút ngắn thời gian, tiết kiệm không gian so với cách thức trồng nấm truyền thống, và có thể chủ động các điều kiện nuôi cấy để đảm bảo sự sinh trưởng tốt nhất của nấm. Bài báo này nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường tới sự phát triển nhằm tạo năng suất cao nhất của sinh khối nấm. Glucose và cao nấm men là hai nguồn cacbon và nitơ tối ưu cho phát triển sinh khối sợi nấm. Ngoài ra ở 280C, pH trong khoảng 5.5 đến 6.0 và tốc độ lắc 150 vòng/phút cũng tạo điều kiện phát triển tốt nhất cho sợi nấm. Với điều kiện này, khi thu sinh khối trong 15 ngày có thể đạt được 29,9 g/l sinh khối khô.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ 
Nấm Thượng hoàng có tên khoa học là Phellinus linteus, họ Hymenochaetaceae, chi Phellinus. Tổng sản lượng của các loài Phellinus trên thế giới khoảng 30 tấn/ năm, chủ yếu từ tự nhiên. Chúng được sử dụng phổ biến tại Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản. Việt Nam là nước có khá nhiều loài Phellinus, tuy nhiên cũng bị khai thác cạn kiệt, tận thu và khó gặp nếu không đi sâu vào các vùng rừng nguyên sinh. Nấm có màu vàng, đường kính 6-12 cm, dày khoảng 2-10 cm, hình bán nguyệt, dạng nhẵn, tròn và hình dạng rất đa dạng. Bề mặt có màu sậm, lông ngắn và dần mất đi khi trưởng thành, khi đó nấm ngả sang màu đen hoặc vàng sậm, bề ngang và bề dọc khác biệt hẳn. Mặt chính giữa thường có màu vàng sáng, mặt dưới màu sẫm. Đây là loài nấm hóa gỗ, thường mọc ở những vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, các khu rừng nguyên sinh nên tuổi nấm có khi lên tới hàng chục năm. Các loại nấm này đang được các nhà khoa học thế giới quan tâm vì đặc tính chống khối u của nó [1, 2]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng nó còn có tác dụng tốt đối với điều trị các bệnh như đái tháo đường, nhiễm khuẩn, bệnh tim, cao huyết áp và có tính kháng viêm loét [3, 4]. Nhu cầu sử dụng nấm này trong việc hỗ trợ nâng cao sức khỏe tại Việt Nam hiện nay cũng khá nhiều. Do nấm tự nhiên hiện tại rất khó tìm và giá thành rất cao, việc nghiên cứu nuôi trồng nấm thượng hoàng là một trong những giải pháp hữu hiệu. Hiện nay, đã có một số nghiên cứu tại Việt Nam tìm đặc điểm sinh trưởng của nấm [5] hay nghiên cứu về các loài cùng chi Phellinus như Phellinus baumi [6] nhằm mục đích như trên. Tuy nhiên, do nấm thích hợp ở vùng khí hậu lạnh và trên núi cao, do đó việc nuôi trồng nhân tạo tại một đất nước có khí hậu nhiệt đới như nước ta là rất khó khăn. Vì vậy, để có được lượng sinh khối tối đa, lên men chìm được quan tâm hơn trong nghiên cứu này. Trong bài này, các điều kiện và thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) ở dạng lên men chìm được đánh giá và lựa chọn. Hàm lượng các chất có trong môi trường tối ưu cũng đã được đánh giá trong nghiên cứu của chúng tôi tuy nhiên kết quả không chỉ ra trong bài này. 
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
2.1. Vật liệu nghiên cứu
 
Chủng nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) GC và GM được thu thập và lưu giữ tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 
Môi trường thạch khoai tây: 200g khoai tây; đun lấy nước trong 20 phút; glucose 20g/l; cao nấm men 1g/l; agar 15g/l. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Các hóa chất khác đạt chuẩn sử dụng cho nghiên cứu vi sinh. 
2.2. Phương pháp nghiên cứu 
Nhân giống: 
Giống nấm được bảo quản trên môi trường thạch khoai tây. Trước các thí nghiệm, giống nấm được hoạt hóa lại trên đĩa thạch khoai tây mới, ủ ở 28°C trong 7-10 ngày. Khi nấm mọc kín đĩa, cắt nhỏ sợi nấm và chuyển sang môi trường lỏng để tiếp tục nuôi cấy trong bình 250ml chứa 50ml môi trường ở 28°C, 150 vòng/phút trong 7 ngày. 
Nghiên cứu tối ưu môi trường cho sự phát triển của nấm: 
Môi trường lỏng ban đầu được chuẩn bị dựa trên tham khảo của Lee và cộng sự [7]. Cụ thể: nguồn cacbon 40 g/l; nguồn nitơ 20 g/l; K2HPO4 0,46 g/l; KH2PO4 1,00 g/l; MgSO4.7H2O 0,5 g/l; FeCl2 0,01 g/l; MnCl2.4H2O 0,036 g/l; ZnCl2 0,03 g/l; CuSO4.7H2O 0,005 g/l. Các điều kiện tối ưu được thay đổi như ở dưới. Sợi nấm được nuôi trong bình tam giác 250ml với 50 ml môi trường đã hấp khử trùng ở 121°C trong thời gian 15-20 phút, và cấy giống nấm theo tỉ lệ 10% giống. Mọi thao tác đổ đĩa, cấy giống được thực hiện trong tủ cấy vi sinh đã được khử trùng bằng đèn tím. Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3, kết quả là giá trị trung bình giữa các lần thí nghiệm. 
Tối ưu nguồn cacbon: Nấm Thượng hoàng được nuôi cấy lắc trong môi trường, lần lượt thay thế glucose bằng fructose, maltose, dextrose với hàm lượng 4%; pH 6; 28°C; 150 vòng/phút; thời gian nuôi cấy 15 ngày. Thu và đánh giá lượng sinh khối sợi nấm 
Tối ưu nguồn nitơ: Môi trường và điều kiện khác như trên, lần lượt thay thế cao nấm men bằng tryptone, peptone, cao thịt bò, dịch chiết ngô (corn steep liquor) với hàm lượng 2%. 
Tối ưu nhiệt độ: Nhiệt độ nuôi cấy được thay đổi gồm 26°C, 27°C, 28°C, 30°C, 33°C; 
Tối ưu vòng lắc: lần lượt thay đổi số vòng: 100, 120, 150, 200 vòng/phút 
Tối ưu pH: lần lượt thay đổi pH môi trường trước khi cấy giống: pH 4; pH 5; pH 5,5; pH 6; pH 7. 
Xác định sinh khối sợi nấm khô: Thu 50 ml dich nuôi cấy nấm, lọc bằng giấy lọc. Sinh khối sợi nấm được sấy ở 50°C tới khối lượng không đổi. 
Xử lý số liệu: Các số liệu được xử lý thống kê sinh học trên máy tính theo chương trình Excel. Các giá trị trong đồ thị là giá trị trung bình của ít nhất 3 lần thí nghiệm độc lập. Độ lệch chuẩn được tính bằng căn bậc hai của giá trị phương sai. Khác biệt được xử lý thống kê bằng phép phân tích biến 1 chiều (one-way Anova) với hậu kiểm (post-hoc) Newman- Keuls test. Giá trị P<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê 
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 
Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 7 năm 2018 đến tháng 1 năm 2019 tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng sợi nấm 

4 nguồn cacbon khác nhau là glucose, fructose, dextrose, maltose có ảnh hưởng đến sinh trưởng của sợi nấm trong môi trường lỏng. Cụ thể là: glucose cho sinh khối cao nhất đạt 29,9 ± 4,16 g/l đối với GM và 26,33 ± 1,14 g/l đối với GC. Cho sinh khối thấp nhất là dextrose đạt 8,17 ± 0,63 g/l đối với GM và 15,24 ± 1,02 g/l đối với GC. Khi xử lý thống kê với one-way anova, giá trị P = 2,64 x 10-6 < 0,05 cho thấy sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê. Kết quả được thể hiện trong Hình 1. Theo kết quả nghiên cứu của Lee và cộng sự đã báo cáo cho thấy maltose là nguồn cacbon phù hợp nhất và họ đã nhấn mạnh rằng sự thay đổi các nguồn cacbon khác nhau làm thay đổi một chút các thành phần của polysaccharide [8]. Hay nghiên cứu của nhóm Lee, June Woo thì fructose là nguồn cacbon tốt hơn cho sự phát triển của sợi nấm [7]. Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi, glucose là nguồn cacbon tối ưu nhất cho cả hai giống nấm được thử nghiệm. Nghiên cứu của chúng tôi có kết quả tương tự như nghiên cứu của Trần Thị Lụa và cộng sự [6] trên nấm Phellinus baumi, nhưng lượng sinh khối thu được của chúng tôi cao gấp 2 lần so với lượng sinh khối mà họ thu được (13,5 g/l với glucose). Như vây, với nguồn cacbon là glucose, lượng sinh khối thu được cao nhất của chúng tôi tương đương với công bố của Lee và cộng sự [7] là 29.9 ± 4,16 g/l. Tuy nhiên như đã nói ở trên, kết quả của nhóm tác giả Lee [7] thu được khi sử dụng fructose làm nguồn cacbon.

Hình 1: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng của sợi nấm. 
3.2. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sinh trưởng sợi nấm
5 nguồn nitơ khác nhau là: cao nấm men, tryptone, peptone, cao thịt bò, dịch chiết ngô có ảnh hưởng đến sinh trưởng của sợi nấm trong môi trường lỏng. Cụ thể ta thấy: cao nấm men cho sinh khối cao nhất đạt 28,47 ± 3,71 g/l đối với GM và 25,77 ± 0,32 g/l với GC. Cho sinh khối thấp nhất là peptone đạt 14,34 ± 1,37 g/l với GC và tryptone đạt 15,46 ± 4,0 g/l đối với GM (P = 0,0001 < 0,05, khác biệt có ý nghĩa thống kê). Kết quả được thể hiện trong Hình 2. Đối với các nguồn nitơ vô cơ như NaNO3, amoni clorua… hầu như không được sử dụng. Các kết quả được báo cáo trước đó nghiên cứu về nhân sinh khối lỏng nấm Phellinus này [7] cũng cho thấy nguồn đạm hữu cơ hiệu quả hơn so với nguồn đạm vô cơ khi sử dụng nhân sinh khối nấm. Điều này có thể do đạm hữu cơ có khả năng thân thiện hơn với sợi nấm so với đạm vô cơ. Cao nấm men cũng là một nguồn nitơ tốt do có giá thành thấp hơn so với các nguồn nitơ khác như tryptone, cao thịt bò do đó nó cũng sẽ phù hợp về mặt kinh tế đối với việc nhân giống trên quy mô lớn. Như vậy, cao nấm men được chọn cho các nghiên cứu tối ưu khác và là nguồn nitơ thích hợp nhất cho GC và GM.
Hình 2: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sinh trưởng của sợi nấm
3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng sợi nấm 
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của sợi nấm, ta thấy tại 28°C sinh khối thu được cao nhất đạt 29,11 ± 1,62 g/l đối với GM và 26,33 ±1,14 g/l đối với GC. Cho sinh khối thấp nhất tại 33°C đạt 20,75 ± 1,12 g/l đối với GM và tại 26°C đạt 20,84 ± 1,17 g/l đối với GC (P = 4,36x10-10 < 0,05, khác biệt có ý nghĩa thống kê). Kết quả được thể hiện trong Hình 3. Trong thí nghiệm này ta thấy nhiệt độ phát triển tối ưu cho cả hai giống nấm là 280C. Kết quả của Phạm Quang Thu [5] xác định nhiệt độ thích hợp cho nấm Phellinus linteus là 250C. Như vậy có sự khác biệt trong nghiên cứu của chúng tôi với nghiên cứu này. Tuy nhiên, khoảng cách nhiệt được thử nghiệm trong thí nghiệm của Phạm Quang Thu là khá xa (50C) do đó, 250C có thể chưa phải là nhiệt độ chính xác nhất cho sự phát triển tối ưu của nấm và kết quả của chúng tôi có độ chính xác cao hơn.

Hình 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của sợi nấm 
3.4. Ảnh hưởng của số vòng lắc đến sinh trưởng sợi nấm 
Số vòng lắc có tác động đến sinh trưởng sợi nấm trong môi trường dịch thể do khi lắc tạo điều kiện cho oxi hòa tan tốt hơn vào trong môi trường và sợi nấm được đảo trộn do đó có sự tiếp xúc đều nhau với môi trường từ trên xuống dưới. Kết quả cho thấy: sinh khối nấm tăng khi tốc độ lắc tăng tuy nhiên tốc độ lắc tối ưu được tìm thấy tại 150 vòng/phút cho sinh khối cao nhất đạt 28,89 ± 2,99 g/l với GM và 26,48 ± 1,42 g/l đối với GC. Lượng sinh khối thấp nhất thu được tại 200 vòng/phút là 19,56 ± 2,95 g/l đối với GM và tại 100 vòng/phút là 19,93 ± 1,85 g/l với GC (P = 0,00325 < 0,05, khác biệt có ý nghĩa thống kê). Kết quả được thể hiện trong Hình 4. Kết quả này tương tự như kết quả của Trần Thị Lụa và cộng sự [6] khi nghiên cứu trên P. baumi. Ở tốc độ cao nhất là 200 vòng/phút, sợi nấm có thể không phát triển tốt nhất do tốc độ này quá mạnh khiến sợi nấm bị đánh nhỏ và nguồn dinh dưỡng cũng bị đảo trộn mạnh, ảnh hưởng đến sự hấp thụ của sợi nấm và do đó ảnh hưởng đến sự phát triển của nó. Ngoài ra ở tốc độ thấp nhất là 100 vòng/phút thì lượng oxi hòa tan không cung cấp đều và phong phú trong môi trường do đó cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm. Như vậy tốc độ lắc 150 vòng/phút là tốc độ thích hợp nhất cho sợi nấm phát triển trong môi trường lỏng ở dạng lên men chìm trong nghiên cứu này.

Hình 4: Ảnh hưởng của số vòng lắc đến sinh trưởng của sợi nấm 
3.5. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng sợi nấm 
Trong thí nghiệm này, pH của môi trường được điều chỉnh trước khi khử trùng môi trường và không điều chỉnh trong quá trình lên men. Kết quả cho thấy tại pH ban đầu là 6,0 sinh khối thu được cao nhất là 29,46 ± 3,73 g/l đối với GM và pH ban đầu là 5,5 cho sinh khối cao nhất đạt 29,24 ± 0,8 g/l đối với GC. Cho sinh khối thấp nhất tại pH ban đầu là 4,0 đạt 12,86 ± 1,15 g/l đối với GM và 11,76 ± 1,24 g/l đối với GC (P = 1,65x10-11 < 0,05, khác biệt có ý nghĩa thống kê). Kết quả được thể hiện trong Hình 5. Như vậy đối với hai giống nấm khác nhau, có sự phân hóa nhẹ trong khi thích nghi với điều kiện môi trường để phát triển. Do đó, việc tối ưu môi trường để tiếp tục nghiên cứu khác cho các giống nấm khác nhau là vô cùng cần thiết. Kết quả với P. baumi thì pH 6,0 thích hợp hơn cả [6], và GM cũng thích hợp để phát triển ở pH 6,0. Trong khi đó, với GC pH 5,5 lại là pH thích hợp nhất cho sự phát triển của nó.


Hình 5: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của sợi nấm 
IV. KẾT LUẬN 
Glucose và cao nấm men được sử dụng làm nguồn cacbon và nitơ tạo điều kiện tốt hơn cho phát triển sinh khối nấm Thượng hoàng. Điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ 280C; pH ban đầu là 5,5~6,0; tốc độ lắc 150 vòng/phút cũng cho thu hoạch cao hơn trong thời gian lên men 15 ngày. Lượng sinh khối nấm thu được cao nhất là 29.9 g/l khi kết hợp các điều kiện trên đối với giống nấm GM. Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng công nghệ lên men chìm trong việc tạo nguồn nguyên liệu quý cho công nghiệp dược phẩm và các thực phẩm chức năng
Lời cảm ơn
Bài báo được hoàn thành với sự tài trợ kinh phí của Bộ Công Thương theo đề tài mã số ĐT.04.18/CNSHCB
TÀI LIỆU THAM KHẢO.
1. H. J. Park, S. Y. Choi, S. M. Hong, S. G. Hwang, and D. K. Park, 2010, The ethyl acetate extract of Phellinus linteus grown on germinated brown rice induces G0/G1 cell cycle arrest and apoptosis in human colon carcinoma HT29 cells, Phytotherapy Research, 24 (7), 1019–1026.
2. T.-I. Jeon, C.-H. Jung, J.-Y. Cho, D. K. Park, and J.-H. Moon, 2013, Identification of an anticancer compound against HT-29 cells from Phellinus linteus grown on germinated brown rice, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 3 (10), 785– 789.
3. Kim HM, Kang JS, Kim JY, Park SK, Kim HS, Lee YJ, Yun J, Hong JT, Kim Y, Han SB, 2010, Evaluation of antidiabetic activity of polysaccharide isolated from Phellinus linteus in non-obese diabetic mouse, Int Immnunopharmacol, 10 (1), 72-78.
4. Lee IK YB., 2007, Highly oxygenated and unsaturated metabolites providing a diversity of hispidin class antioxidants in the medicinal mushrooms Inonotus and Phellinus, Bioorg Med Chem, 15 (10), 3309-3314.
5. Phạm Quang Thu, 2016, Đặc điểm sinh học của nấm thượng hoàng (Phellinus linteus) trong nuôi cấy thuần khiết, Tạp chí Khoa học lâm nghiệp, 1, 4231 - 4237.
6. Trần Thị Lụa, Vũ Văn Hạnh, 2017, Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối nấm thượng hoàng vàng (Phellinus baumi), Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 8 (81), 106-108.
7. June Woo Lee, Seong Jin Back, Yong Seak Kim, 2008, Submerged Culture of Phellinus linteus for Mass Production of Polysaccharides, The Korean Society of Mycology – Mycobiology, 36 (3), 178-182.
8. Lee, J. H; Cho, S. M; Ko, K. S. and Yoo, I. D., 1995, Effect of cultural condition on polysaccharide production and its monosaccharide composition in Phellinus linteus L13202, Kor. J. Mycol., 23 (4), 325-331.
Trần Thị Hiền1- Trần Văn Tuấn1 - Nguyễn Thị Lý2 - Trần Thị Hoa2 - Nguyễn Thị Minh Huyền2 
1 Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội 
2 Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Theo Bản tin KHCN ngành Công Thương số 6 năm 2020
Tổng số lượt truy cập :
  • 1
  • 4
  • 6
  • 0
  • 3
  • 0
  • 0
lên đầu trang