Thứ sáu, 29/03/2024 | 22:53

Thứ sáu, 29/03/2024 | 22:53

Bài báo khoa học

Cập nhật 08:20 ngày 07/08/2020

Nghiên cứu sử dụng Enzyme hỗ trợ quá trình trích ly chondroitin Sulfate từ sụn khớp chân gà

TÓM TẮT: 
Glycosaminoglycan (GAG) là một hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide, tham gia vào hoạt động cấu tạo mô sụn, có thể được thu nhận từ mô sụn động vật như sụn cá mập, sụn gà, cá nhám… Trong GAG chứa lượng lớn chondroitin sulfate (CS) có tác dụng phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh về khớp. Tuy nhiên, hiện nay, Việt Nam chưa có công nghệ sản xuất CS thương mại mà hoàn toàn phải nhập khẩu từ nước ngoài. Do đó, việc trích ly và thu nhận CS từ nguồn phụ phẩm của ngành công nghiệp giết mổ gia súc, gia cầm là cần thiết nhằm thay thế hàng ngoại nhập. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã xác định được chế phẩm papain thương mại của SCIYU Biotech (Trung Quốc) là thích hợp cho quá trình trích ly CS từ sụn khớp chân gà, với hiệu suất trích ly CS lớn nhất là 90,6%, ở các điều kiện tối ưu sau: tỷ lệ sụn chân gà so với nước là 1:6w/v, tỷ lệ enzyme so với sụn chân gà 0,8%w/w, nhiệt độ thủy phân 600C, thời gian 12h.
MỞ ĐẦU 
Chondroitin sulfat (CS) là một hợp chất thiên nhiên thuộc nhóm glycosaminoglycan (GAG) hay mucopolysacchride có khối lượng phân tử từ 10.000 - 100.000 Dalton, được tổng hợp ở cơ thể động vật bậc cao, và tồn tại trong mô liên kết. CS khi được uống vào cơ thể có chức năng tái tạo các mô sụn và xương, phụ trợ cho quá trình tổng hợp của cơ thể giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp ở người lớn tuổi hoặc người vận động cơ bắp ở mức độ cao. Nó cũng là thành phần cần thiết để nuôi dưỡng tế bào giác mạc. CS chiếm tỷ lệ cao, từ 70-85% trong nhóm GAG thường được trích ly từ các loại sụn của động vật, như sụn cá mập, cá đuối, sụn mũi lợn, trâu, bò hoặc sụn ức gà… [1,2]. 
Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã chỉ ra rằng phương pháp sinh học dùng enzym để thuỷ phân mô sụn động vật có hiệu quả cao để thu nhận CS mà không bị biến đổi về cấu trúc, giữ được hoạt tính sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do các hoá chất (muối, kiềm, axit) gây nên [2,3]. Để tách các phân tử CS ra khỏi protein lõi của sụn có nguồn gốc từ các loại phụ phẩm chế biến gia súc, gia cầm, người ta thường sử dụng enzyme protease để phân cắt protein lõi thành các axit amin và peptide, giải phóng GAG [4,5]. Lou và cộng sự (2002) đã sử dụng papain để thủy phân sụn ức gà, kết quả cho thấy hàm lượng GAG là 33 mg trong 1 gam sụn ức gà tươi (trong đó CS chiếm 76%) [2]. Shin và cộng sự (2006) đã sử dụng chế phẩm alcalase để phân giải protein của sụn ức gà, kết quả cho thấy đã có khoảng 73-76% CS được giải phóng khỏi các Proteoglycan (PG) sau quá trình thủy phân bằng enzyme so với chỉ có 35-40% nếu chỉ đun sôi bằng nước [3]. Vittayamont và cộng sự (2014) đã sử dụng chế phẩm papain để thủy phân PG của sụn khí quản vịt nhằm tạo ra các loại CS4 và CS6. Kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân tăng từ 50% lên 80% sau khi tăng thời gian thủy phân từ 1h lên 10h ở nồng độ enzyme tối ưu là 0,25% [4]. Mới đây, Đống Thị Anh Đào và Cộng sự (2018) đã sử dụng chế phẩm protamex để thủy phân sụn ức gà cho hiệu suất thu hồi GAG thô là 24,77% so với sụn ức gà khô [1]. 
Hiện nay, ở Việt Nam, nguồn nguyên liệu CS cho sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng hoàn toàn phải nhập ngoại [1]. Trong khi đó, nguồn nguyên liệu gia cầm ở Việt Nam là khá lớn (cả nước đạt 400,9 triệu con theo Niên giám Thống kê 2018). Do vậy, nguồn phụ phẩm sau quá trình giết mổ, sản xuất thịt như xương, sụn, đặc biệt là sụn khớp chân gà sẽ là một nguồn nguyên liệu phong phú cho ngành công nghiệp sản xuất CS. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày các kết quả nghiên cứu sử dụng enzyme hỗ trợ quá trình trích ly CS từ sụn khớp chân gà, do đây là một công đoạn rất quan trọng trong công nghệ sản xuất CS. 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 
Nguyên liệu và hóa chất: Khuỷu chân gà công nghiệp của Việt Nam. Các chế phẩm enzyme của Novozyme (Đan Mạch) được cung cấp bởi công ty Brentag Việt Nam, bao gồm: chế phẩm flavourzyme 1000L có hoạt độ 1.100 LAPU/g, chế phẩm alcalase 2.5L có hoạt độ 2,5 AU.A/g, chế phẩm trypsin có hoạt độ 800 USP/mg và chế phẩm neutrase 0.8L có hoạt độ 0.8 AU-N/g. Chế phẩm papain của Sigma – Mỹ có hoạt độ 10.000 UI/g và chế phẩm papain của SCIYU Biotech (Trung Quốc) có hoạt độ 50.000 UI/g. Các hóa chất phân tích của Merck (Đức) và Sigma (Mỹ). 
Trích ly CS từ sụn khớp chân gà: Khuỷu chân gà (công nghiệp 45-50 ngày tuổi) ngay sau khi mua về được rửa sạch bằng nước máy và được đun sôi 1 giờ, tách sụn khớp gối, nghiền nhỏ và bảo quản ở -200C. Trích ly CS từ sụn chân gà được thực hiện bằng enzyme theo phương pháp cải tiến của Ganjanagoochor và cộng sự (2007) [5]. Hòa tan 100 gam sụn khớp chân gà với nước theo tỷ lệ 1:8 v/v. Hỗn hợp sau đó được bổ sung từng loại chế phẩm enzyme protease như papain, alcalase, trypsin, neutrase và flavourzyme ở các điều kiện tối ưu theo khuyến cáo của nhà sản xuất (Bảng 1). Sau 8-16h thủy phân, hỗn hợp được ly tâm ở 6.000 vòng/phút, trong 30 phút ở 50C. Dịch nổi được thu hồi, định lượng và phân tích hàm lượng CS để xác định hiệu suất trích ly CS. Mẫu đối chứng không sử dụng enzyme được đun sôi ở 1000C trong 8-16h. 
Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly CS từ sụn khớp chân gà bằng chế phẩm papain SCIYU: Các thông số công nghệ của quá trình trích ly lần lượt được khảo sát là tỷ lệ sụn khớp chân gà so với nước từ 1:2 đến 1:10w/v, tỷ lệ chế phẩm enzyme papain so với sụn chân gà từ 0,2-1,0%w/w, ở nhiệt độ từ 50- 700C, trong thời gian từ 4-20h. Sau mỗi quá trình thủy phân kết thúc, hỗn dịch được ly tâm ở 6.000 vòng/ phút, trong 30 phút ở 50C. Dịch nổi được thu hồi, định lượng và phân tích hàm lượng CS.
Bảng 1. Các thông số công nghệ của quá trình thủy phân sụn khớp chân gà bằng các loại chế phẩm enzyme protease khác nhau

Phương pháp xác định hàm lượng CS: CS được xác định theo phương pháp của Somashekar và cộng sự (2011) dựa trên phản ứng của phân tử CS và xanh methylene [6]. Hiệu suất trích ly CS được tính bằng % giữa hàm lượng CS thu được sau khi trích ly so với hàm lượng CS có trong sụn khớp chân gà. Hàm lượng CS trong sụn khớp chân gà đã được xác định là 3,6% khi thủy phân bằng enzyme papain (Sigma, Mỹ) ở điều kiện tối ưu: tỷ lệ enzyme/sụn bằng 0,5%, nhiệt độ 650C, pH 7,5 trong thời gian 16h). 
Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm thống kê SAS 9.0. Các giá trị là trung bình của ba lần thí nghiệm. 
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 
Xác định loại chế phẩm enzyme protease thương mại thích hợp cho quá trình trích ly CS từ sụn khớp chân gà 
Các kết quả được trình bày ở Bảng 2 cho thấy ảnh hưởng mạnh của các loại chế phẩm papain, flavourzyme, alcalase và trypsin… được sử dụng trong quá trình trích ly sụn chân gà tới hiệu suất trích ly CS. Theo đó, chế phẩm papain SCIYU có hiệu suất trích ly CS từ sụn khớp chân gà đạt các giá trị lớn nhất, tương ứng là 72,5% (sau 8h trích ly) và 80,5% (sau 16h trích ly). Tiếp theo là chế phẩm flavourzyme có hiệu suất trích ly CS tương ứng là 70,9% và 75,8%. Các giá trị này cao gấp 3 đến 4 lần so với đối chứng không sử dụng enzyme. Các chế phẩm enzyme còn lại như là alcalase, trypsin và neutrase có hiệu suất trích ly CS thấp hơn so với các chế phẩm papain SCIYU và flavourzyme, chỉ đạt tương ứng từ 58,8% đến 62,6% (sau 8h) và 68,4 đến 70,6% (sau 16h), nhưng vẫn lớn hơn từ 2 đến 3 lần so với các giá trị này của mẫu đối chứng không sử dụng enzyme. Kết quả này cho thấy vai trò đặc biệt quan trọng của các enzyme protease trong việc thủy phân, thu nhận các hoạt chất sinh học từ nguyên liệu tự nhiên. Tương tự như các kết quả được trình bày trong nghiên cứu này, theo Nakano và cộng sự (2012), so với các chế phẩm trypsin, flavourzyme, pancreatin thì chế phẩm papain tỏ ra có hiệu quả nhất để giải phóng các phân tử CS-peptide có phân tử lượng thấp khỏi các proteoglycan của các loại sụn gà thu được từ các loại phụ phẩm của quá trình chế biến gà rút xương [7]. 
Tuy nhiên, Xie và cộng sự lại cho thấy các chế phẩm neutrase và alcalase là tốt nhất cho thủy phân sụn vây cá mập, cho hiệu suất trích ly CS đạt 94%, so với các chế phẩm khác như bromelain và papain chỉ cho các giá trị này tương ứng là 80% và 85% [8]. Điều này cho thấy hiệu quả thủy phân không giống nhau của các loại enzyme trên các proteoglucan để giải phóng CS từ các loại nguyên liệu sụn có nguồn gốc khác nhau.
Bảng 2. Ảnh hưởng của các loại chế phẩm enzyme protease tới hiệu suất trích ly CS từ sụn khớp chân gà
Xác định các điều kiện thích hợp để trích ly CS từ sụn khớp chân gà bằng chế phẩm papain SCIYU 
Kết quả được trình bày trong các Hình 1a, b, c và d cho thấy các điều kiện công nghệ có ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly CS từ sụn khớp gối chân gà bằng chế phẩm papain. Hình 1a cho thấy tỷ lệ nguyên liệu sụn: nước càng tăng thì hiệu suất trích ly CS từ sụn khớp chân gà càng giảm, sau 16h trích ly. Khi tỷ lệ này bằng 1:10 cho hiệu suất trích ly CS từ sụn chân gà đạt giá trị lớn nhất là 81,2%. Điều này có thể được giải thích là do khi tỷ lệ nước so với nguyên liệu sụn càng lớn thì động lực chuyển khối của CS vào hỗn hợp thủy phân càng cao và do vậy làm tăng hiệu suất trích ly CS (theo Xie và cộng sự (2014)) [8]. Tuy nhiên, tỷ lệ 1:6 lại được chọn là thích hợp nhất cho quá trình trích ly CS từ sụn khớp chân gà, do nó cho hiệu suất trích ly CS tương đối cao là 79,8%, thấp hơn không đáng kể so với giá trị này ở tỷ lệ 1:10. Ngoài ra, trích ly ở tỷ lệ 1:6 cho phép hạn chế một lượng lớn nước đưa vào trích ly so với tỷ lệ 1:10 nên sẽ giảm được thể tích sử dụng của thiết bị và tiết kiệm năng lượng cũng như giảm được lượng nước cần phải tách bỏ trong công đoạn cô đặc dịch CS sau này. Nguyễn Thị Lê Viên và cộng sự (2017) cũng đã cho thấy hiệu suất thu hồi CS so với sụn ức gà khô ban đầu tăng từ 8,33% lên 13,96% khi tỷ lệ nguyên liệu : nước của quá trình thủy phân giảm từ 1:4 xuống 1:10 [9]. Hình 1b cho thấy tỷ lệ enzyme sử dụng so với nguyên liệu càng tăng thì hiệu suất trích ly CS khỏi sụn khớp chân gà càng lớn. Khi thủy phân (trong 16h) sụn khớp chân gà với tỷ lệ chế phẩm papain: nguyên liệu sụn bằng 1,0% cho hiệu suất trích ly CS lớn nhất đạt 90,1%, tiếp theo là tỷ lệ 0,8% cho hiệu suất cũng tương đương là 88,5%. Các tỷ lệ enzyme:nguyên liệu khác cho các hiệu suất trích ly CS thấp hơn hẳn 2 trường hợp trên, chỉ đạt từ 70,8% đến 80,9%. Nguyễn Thị Lê Viên và cộng sự (2017) cũng đã cho thấy hiệu suất thu hồi CS so với sụn ức gà khô đạt giá trị lớn nhất là 14,34% ở tỷ lệ chế phẩm papain bổ sung so với sụn ức gà là 0,6% và tăng tỷ lệ này lên 0,7%-1% đã không làm tăng giá trị này [9]. 
Hình 1. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ tới hiệu suất trích ly CS từ sụn chân gà (a: tỷ lệ nguyên liệu: nước từ 1:10 đến 1:2; b: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu từ 0,2-1,0%; c: nhiệt độ thủy phân từ 50-700C và d: thời gian thủy phân từ 4-20h.
Hình 1c cho thấy khi tăng nhiệt độ thủy phân (từ 500C lên 60 0C) sụn khớp chân gà bằng chế phẩm papain với tỷ lệ 0,8% so với nguyên liệu đã làm tăng hiệu suất trích ly CS từ sụn khớp chân gà từ 75,6% (thấp nhất) lên 90,8% (cao nhất). Nhưng nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân lên 650C và 700C thì lại làm giảm hiệu suất trích ly CS xuống còn 88,6% và 82,2%, tương ứng. Một số nghiên cứu trước đây đã sử dụng nhiệt độ 650C cho quá trình thủy phân CS từ sụn cổ hũ vịt của Vittayamont và cộng (2014) [4], từ sụn ức gà của Lou và cộng sự (2002) [2] và Nguyễn Thị Lê Viên và cộng sự (2017) [9] và từ sụn mũi trâu của Sundaresan và cộng sự (2018) [10]. Điều này có thể được giải thích là do trong các nghiên cứu này có sự khác biệt về hoạt độ và tính chất của các chế phẩm papain được sử dụng so với nghiên cứu của chúng tôi. Chẳng hạn như, nghiên cứu của chúng tôi sử dụng chế phẩm papain của SCIYU Biotech (Trung Quốc) có hoạt độ 50.000 UI/g, so với các chế phẩm papain trong nghiên cứu được tham khảo ở trên có hoạt độ từ 2.256 –3.000 UI. 
Cuối cùng, hình 1d cho thấy thời gian thủy phân có ảnh hưởng tỷ lệ thuận với hiệu suất trích ly CS từ sụn khớp chân gà, tăng từ 74,6% lên 91,8% khi kéo dài thời gian từ 4 đến 20h. Tuy nhiên, thời gian thủy phân sụn khớp chân gà trong 12h là thích hợp nhất cho quá trình trích ly CS, do có hiệu suất đạt giá trị cao là 90,6%, thấp hơn không đáng kể so với giá trị lớn nhất là 91,8% (sau 20h). Tương tự như các kết quả thu được của chúng tôi Widyaningsih và cộng sự (2016) đã cho thấy hiệu suất trích ly CS đạt 100% sau 24h trích ly bằng chế phẩm papain với tỷ lệ bổ sung so với bột sụn chân gà là 0,4%. Khi kéo dài thời gian trích ly tới 48h không ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly CS từ sụn chân gà [11]. 
KẾT LUẬN 
Từ các kết quả thu được ở trên có thể thấy rằng trong các chế phẩm enzyme thương mại được sử dụng, chế phẩm enzym papain của SCIYU Biotech (Trung Quốc) là phù hợp nhất cho quá trình trích ly CS từ sụn khớp chân gà ở điều kiện tỷ lệ sụn so với nước là 1:6w/v, tỷ lệ chế phẩm papain so với sụn là 0,8%w/w, ở nhiệt độ 600C, trong thời gian 12h. Ở điều kiện này, hiệu suất trích ly từ sụn khớp chân gà đạt 90,6%. Các kết quả này là chìa khóa quan trọng làm cơ sở tiến hành quá trình trích ly và sản xuất CS từ sụn chân gà quy mô lớn hơn.
Lời cảm ơn 
Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Công Thương đã cấp kinh phí và sự quan tâm tạo điều kiện mọi mặt của Viện Công nghiệp thực phẩm và Viện Công nghệ sinh học và Hóa dược NOVA để thực hiện nghiên cứu này. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Đống Thị Anh Đào và cộng sự, 2018, Nghiên cứu thu nhận chondroitin sulfate từ sụn ức gà, Báo cáo tổng kết Đề tài thuộc chương trình khoa học công nghệ cấp TP-HCM, trường Đại Học Bách khoa ĐHQG TPHCM. 
2. Luo X.M, Fosmire G.J and Leach R.M, 2002, Chicken keel cartilage as a source of chondroitin sulfate. Poult. Sci., 81, 1086-1089. 
3. Shin S.C, You S.J, An B.K and Kang C.W, 2005, Study on Extraction of Mucopoly-saccharide Protein Containing Chondroitin Sulfate from Chicken Keel Cartilage, Asian Australian Journal Animal, 19 (4): 601-604. 
4. Vittayanont M and Jaroenviriyapap T, 2014, Production of crude chondroitin sulfate from duck trachea, International Food Research Journal, 21(2): 791-797. 
5. Garnjanagoonchorn W, Wongekalak L, Engkagul A, 2007, Determination of chondroitin sulfate fromdifferent sources of cartilage, Chem. Eng. Proc., 46: 465–471. 
6. Somashekar P.L, Tripathy A.S, Sathish K.P, Chandrashekar J and Palakshi G.O, 2011, Colorimetric estimation of chondroitin sulfate in bulk drug and pharmaceutical formulation using cationic dye methylene blue, Der Pharma Chem., 3: 90–96 
7. Nakano T and Betti M, 2012, Extraction, Isolation and Analysis of Chondroitin Sulfate from Broiler Chicken Biomass, Process Biochemistry, 47(12): 1909-1918. 
8. Xie J, Ye Y and Luo X, 2014, An efficient preparation of chondroitin sulfate and collagen peptides from shark cartilage, International Food Research Journal, 21, 1171-1175. 
9. Nguyen Thi Le Vien, Pham Bao Nguyen, Lam Duc Cuong and Dong Thi Anh Dao, 2017, Optimization of papain hydrolysis conditions for release of glycosaminoglycans from the chicken keel cartilage, AIP Conference Proceedings, 1878, 020009: 1-12. 
10. Widyaningsih T.D, Rukmi W.D, Sofia, E, Wijayanti S.D, and Nangin D, 2016, Extraction of Glycosaminoglycans Containing Glucosamine and Chondroitin Sulfate from Chicken Claw Cartilage, Research Journal of Life Science, 3(3): 181-189. 
11. Sundaresan G, Robinson A.J, Appa R.V, Narendra B.R, Govind V, Mahantesh M.F, 2018, Established method of chondroitin sulphate extraction from buffalo (Bubalus bubalis) cartilages and its identification by FTIR, J. Food Sci. Technol., 55(9):3439–3445.
Trương Hương Lan*, Lại Quốc Phong, Phạm Đức Thuận, Đặng Trần Hoàng và Phạm Thị Lê Hương
*Viện Công nghiệp Thực phẩm
Theo Bản tin KHCN ngành Công Thương số 6 năm 2020

Tổng số lượt truy cập :
  • 1
  • 0
  • 3
  • 8
  • 8
  • 6
  • 3
  • 6
lên đầu trang