Nghiên cứu này đã thực hiện xác định đặc tính sinh hóa của rễ củ Đảng sâm (Codonopsis Javanica (Blume) Hook. F and Thomson) cho thấy, các chất dinh dưỡng của Đảng sâm gồm: protein chiếm 6,4%, đường tổng (đường khử) chiếm 40,1% và protein chiếm 0,9% tính theo chất khô. Trích ly được chiết xuất Đảng sâm sử dụng xúc tác là enzyme α-amylase ở điều kiện tối ưu, chiết xuất có độ Brix là 2,7%, hàm lượng saponin đạt 1,54%, có hoạt tính kháng oxy hóa (bắt gốc DPPH) đạt mức 58,7%, nhưng không có tính kháng khuẩn.

Từ khóa: đảng sâm, saponin, α-amylase (Termamyl), DPPH, núi Ngọc Linh.

Đảng sâm (còn gọi là Lộ Đảng sâm, Xuyên Đảng sâm, Rầy cáy, Mần cáy, sâm dây) có tên khoa học là Codonopsis javanica, thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae). Sau khi trồng 18 - 20 tháng có thể thu hoạch khi cây lụi tàn. Đảng sâm là cây dược liệu quý, có giá trị dược liệu cao [9]. Đảng sâm thường được dùng trong trường hợp thiếu máu, vàng da, bệnh bạch huyết, viêm thượng thận, nước tiểu có albumin, chân phù đau, chữa ho, tiêu đờm, lợi tiểu [2]. Đảng sâm được xem là “nhân sâm của người nghèo” vì có tác dụng chữa bệnh như nhân sâm nhưng giá lại rẻ hơn [2]. Người dân thường dùng để ngâm rượu hoặc sắc để uống bồi bổ sức khỏe. Đảng sâm phân bố nhiều ở các tỉnh Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Kon Tum, Lâm Đồng, Quảng Nam [13]. Từ năm 1960, tại Việt Nam bắt đầu phát hiện và khai thác Đảng sâm tại những nơi có khí hậu mát như Lào Cai, Lai Châu, Lạng Sơn, Cao Bằng,… riêng tại tỉnh Kon Tum trong các năm từ 1990 trở về trước khối lượng khai thác lên đến khoảng 2 - 3 tấn/năm [2]. Tuy nhiên, trước đây, do khai thác chủ yếu từ tự nhiên, nên dẫn đến nguồn Đảng sâm trong tự nhiên bị cạn kiệt. Hiện nay, ở khu vực miền Trung và Tây Nguyên, Ủy ban nhân dân tỉnh Quảng Nam và Kon Tum đã lần lượt phê duyệt các Nghị quyết số 202/2016/NQ-HĐND và số 09/2018/NQ-HĐND để bảo tồn và phát triển nguồn cây dược liệu, trong đó có cây Đảng sâm, cụ thể là: hỗ trợ cho người nông dân trồng mới tại Tây Giang (Quảng Nam) và vùng xung quanh núi Ngọc Linh (Kon Tum). Do đó, mở ra cơ hội phát triển bền vững loài Đảng sâm trong khu vực và giúp cung ứng nguồn nguyên liệu ổn định ra thị trường. Với tiềm năng ứng dụng rất lớn của Đảng sâm, việc nghiên cứu chế biến các sản phẩm từ Đảng sâm và nâng cao giá trị gia tăng của sản phẩm là một yêu cầu cấp thiết được đặt ra.

Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có những nghiên cứu bước đầu về Đảng sâm, các nhà khoa học chủ yếu tập chung vào việc nghiên cứu thành phần hóa học của rễ củ Đảng sâm khai thác ở các tỉnh phía Bắc như Sa Pa - Lào Cai [5]. Đồng thời, bước đầu nghiên cứu khai thác dịch chiết từ rễ củ Đảng sâm bằng amylase tại Đà Lạt - Lâm Đồng [12]. Tuy nhiên, thông tin khoa học về Đảng sâm khai thác ở Kon Tum còn rất ít. Vì thế, nghiên cứu này tập chung vào xác định thành phần hóa học của rễ củ và đặc tính kháng gốc oxy hóa DPPH và kháng khuẩn của chiết xuất từ rễ củ Đảng sâm khai thác ở Kon Tum sử dụng enzyme α-amylase để xúc tác phản ứng thủy phân. Kết quả nghiên cứu làm nền tảng cho việc xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất nước cốt Đảng sâm để đưa vào sản xuất nước giải khát Đảng sâm đóng chai.

- Đảng sâm 2 năm tuổi được lấy mẫu từ núi Ngọc Linh thuộc địa phận huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum (Hình 1). Mẫu Đảng sâm tươi sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm được rửa sạch, để ráo nước, sau đó được bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ 18⁰C - 20⁰C phục vụ nghiên cứu.

- Enzyme α-amylase (Termamyl SC DS của Novozymes) - EC 3.2.1.1 được cung cấp bởi Công ty TNHH Brenntag Việt Nam (TP. Hồ Chí Minh), Termamyl® SC DS là endo-amylase xúc tác đặc hiệu phản ứng thủy phân liên kết (1,4)-alpha-D-glycoside trong tinh bột và polysaccharide, có hoạt độ là 120 KNU-S/g ở pH= 4,8-6,6, tối ưu ở pH=5,5, chế phẩm enzyme ở dạng dung dịch có màu hổ phách (Amber). Việc sử dụng α-amylase được cho là có thể cho phép thu được dịch chiết có độ ngọt đậm đà hơn so với các phương pháp sử dụng các loại xúc tác khác [11].

Độ ẩm của Đảng sâm tươi được xác định theo phương pháp KN/QTKT/6.1, nguyên liệu được sấy tại t=105⁰C tới khối lượng không đổi; Tro toàn phần được xác định theo phương pháp KN/QTKT/6.1, nguyên liệu được tro hóa ở t = 750⁰C ở điều kiện yếm khí; Lipid tổng số được định lượng theo phương pháp KN/QTKT/10.2, mẫu nguyên liệu sau khi sấy tới độ ẩm không đổi, sau đó được chiết lipid theo kỹ thuật chiết Soxhlet; Protein tổng số (thô) được xác định bằng phương pháp KN/QTKT/6.1, mẫu nguyên liệu sau khi sấy tới độ ẩm không đổi được định lượng và đem đi xác định ni-tơ tổng số bằng kỹ thuật Kjeldahn; Polysaccharide tổng được xác định được định lượng theo phương pháp KN/QTKT/10.6; Saponin tổng được xác định theo phương pháp KN/QTKT/10.5; Đường tổng được xác định theo phương pháp KN/QTKT/10.9 (kỹ thuật DNS). Xác định thành phần hóa học nguyên liệu Đảng sâm được chúng tôi tiến hành tại Trung tâm Kiểm nghiệm - Viện Thực phẩm Chức năng (VIDS) theo Dược điển Việt Nam IV [3].

Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn được thực hiện theo phương pháp của Hadacek et al. (2000). Ba loại vi khuẩn (Staphylococcus aureus; Escherichia coli và Salmonella sp.) được tiến hành hoạt hóa nuôi trong môi trường Buffered Peptone Water (BPW) của hãng Merk (CHLB Đức) trong 24 giờ ở 37^oC. Vi khuẩn sau khi hoạt hóa được cấy trải trên môi trường BPW. Tiến hành đục lỗ thạch với đường kính lỗ là 6mm. Hút lần lượt các mẫu cho vào lỗ thạch. Nuôi cấy trong 24 giờ ở 37^oC. Đối chứng âm được sử dụng là nước cất, đối chứng dương là ampicillin (50µg/ml). Khả năng kháng khuẩn của các mẫu nước chiết Đảng sâm được xác định bằng cách đo đường kính của vùng ức chế theo công thức (1).

                                     X = D - d                                                   (1)

Trong đó: X - Đường kính kháng khuẩn (mm); D - Đường kính vòng vô khuẩn (mm); d - Đường kính lỗ thạch (mm) [4].

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một chất tạo ra gốc tự do (free radical) có khả năng hấp thụ bước sóng cực đại ở 517nm và có màu tím. Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Với mẫu chiết xuất đã thu nhận được sau phản ứng quá trình thủy phân, tiến hành xác định khả năng bắt gốc DPPH song song với mẫu đối chứng để đánh giá. Tiến hành: 2 mL mẫu thêm 2 mL 0,05 mM DPPH được pha trong ethanol 95%. Trộn đều, để phản ứng trong bóng tối 30 phút, nhiệt độ phòng, sự hấp thụ của dung dịch được đo ở bước sóng 517 nm. Xác định độ hấp thụ của hỗn hợp để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thí nghiệm. Độ hấp thụ giảm càng mạnh thì hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thí nghiệm thông qua khả năng nhường hydro càng lớn [1], [8]. Kết quả được tính theo công thức (2).

                                 DPPH (%) = (1 – Ac - As/Ac) x 100  (2)

Trong đó, As -  Độ hấp thụ của mẫu cùng với DPPH;; Ac -  Độ hấp thụ của DPPH với mẫu đối chứng.

Phương pháp thu chiết xuất Đảng sâm được tiến hành theo nghiên cứu của Trương Hoàng Duy và cs. (2015) [12], có điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Cụ thể, chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm trong 4 bình tam giác 250mL, mỗi mẫu gồm 25g Đảng sâm tươi xay nhuyễn và bổ sung nước theo tỷ lệ nguyên liệu: nước là 1:8 (w/v), điều chỉnh pH = 5,5 bằng acid citric. Sau đó, bổ sung enzyme α-amylase vào các mẫu theo thứ tự 0%; 0,45%; 0.5%; 0.55% tính theo khối lượng nguyên liệu (w/w), khuấy đều. Tiếp tục, tiến hành phản ứng trong thiết bị phản ứng ổn nhiệt Stuart SI 500, thực hiện phản ứng ở nhiệt độ t = 83-85⁰C trong thời gian - 1,9 giờ tính từ thời điểm nhiệt độ hỗn hợp phản ứng đạt được nhiệt độ như mong muốn và liên tục khuấy đảo với vận tốc lắc v=200 vòng/phút. Phản ứng enzyme được kiểm soát bằng máy đo Brix, độ Brix ở mức 2,0-2,8% (tùy thuộc từng mẫu) khi phản ứng kết thúc là đạt yêu cầu. Kết thúc thời gian thủy phân, nâng nhiệt khối dịch thủy phân lên 95⁰C trong 15 phút bằng cách đun sôi cách thủy các hỗn hợp phản ứng, sau đó để nguội. Tiếp tục lọc dịch chiết bằng giấy lọc, cấp độ lọc 1-2micron để thu dịch trong và loại bỏ cặn. Dịch chiết được bảo quản trong các bình tam giác có nắp đậy ở nhiệt độ 0-5⁰C không quá 72 giờ để khảo sát hoạt tính sinh học.

- Để khảo sát khả năng kháng oxy hóa (bắt gốc DPPH), lấy mẫu dịch chiết thu được sau phản ứng (từ 04 mẫu) để khảo sát ở các mức nồng độ khác nhau theo độ pha loãng của dịch chiết xuất là 0%, 10%, 20% và 30%, từ đó chọn ra mẫu có khả năng kháng oxy hóa mạnh nhất để thiết lập nồng độ enzyme α-amylase tối ưu cho phản ứng thủy phân nguyên liệu rễ củ Đảng sâm.

- Khảo sát khả năng kháng khuẩn được tiến hành như sau: lấy mẫu dịch chiết xuất từ mỗi bình tam giác (4 mẫu) để khảo sát khả năng kháng 3 loại vi khuẩn gây hại thực phẩm (Staphylococcus aureus; Escherichia coli và Salmonella sp), song song, làm thí nghiệm với 1 đối chứng dương và 1 đối chứng âm.

Mỗi thí nghiệm được thực hiện song song 3 lần, mỗi lần 3 mẫu. Số liệu được xử lý và tính toán trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010 (giá trị của p < 0.05)

Thành phần hóa học của nguyên liệu cho chúng ta biết đặc tính kỹ thuật của nguyên liệu, nó cung cấp thông tin cho các nhà khoa học và kỹ thuật viên để đưa ra giải pháp bảo quản và chế biến phù hợp. Kết quả xác định đặc tính sinh hóa của nguyên liệu rễ củ Đảng sâm được trình bày trong Bảng 1.

Phân tích dữ liệu trong Bảng 1 cho thấy, thành phần các chất dinh dưỡng trong nguyên liệu rễ củ Đảng sâm tươi tương đối cao, trong đó, protein chiếm 6,4% chất khô, đường tổng (đường khử) chiếm 40,1% chất khô và protein chiếm 0,9% chất khô. Như vậy, nguyên liệu Đảng sâm ngoài giá trị dược liệu còn có thể xem là một nguyên liệu thực phẩm giàu chất dinh dưỡng. Hai thành phần có giá trị sinh học của rễ của Đảng sâm là saponin và polysaccharide, trong đó, saponin chiếm 2,1% chất khô và polysaccharide chiếm 36,4% chất khô. Saponin là thành phần dược liệu quan trọng được các nhà khoa học tìm thấy trong Đảng sâm của Việt Nam [5], saponin là một nhóm glycoside lớn trong thực vật, có vị đắng, tan trong nước và alcol, có khả năng tạo bọt [6]. Một số saponin có tác dụng kháng khuẩn, chống viêm, ức chế virus,… nên được dùng như thuốc bổ, tăng lực, chống nhược sức, chống stress và lão hóa [10]. Tương tự, các polysaccharide cũng là hợp chất glycoside, một số polysaccharide nguồn gốc từ sâm được chứng minh có khả năng tăng cường miễn dịch và kháng virus như polysaccharide trong sâm Đương quy, nên được dùng để điều chế thuốc chống suy giảm miễn dịch và thuốc kháng cúm như thuốc Somanimm [6]. Tuy nhiên, dữ liệu về vai trò của thành phần polysaccharide của Đảng sâm tại Việt Nam còn hạn chế, nhóm nghiên cứu sẽ tiếp tục phân lập và định danh trong các nghiên cứu tiếp theo.

Sunwoo H. H. (2013) đã tiến hành kết hợp các enzyme cellulase, α-amylase, viscozyme xúc tác phản ứng thủy phân nguyên liệu nhân sâm để thu nhận saponin và kết quả cho thấy, khi sử dụng enzyme α-amylase để xúc tác phản ứng thủy phân có thể thu được chiết xuất với hàm lượng saponin cao và sự khác biệt giữa việc sử dụng enzyme cellulase và enzyme α-amylase là không đáng kể [10]. Như vậy, việc sử dụng enzyme α-amylase để xúc tác cho phản ứng thủy phân nguyên liệu sâm để chiết xuất hoạt chất sinh học cho đối tượng Đảng sâm là hướng ứng dụng khả thi. Tại Việt Nam, Trương Hoàng Duy và cs. (2015) đã sử dụng enzyme α-amylase để tiến hành trích ly hợp chất saponin thô từ Đảng sâm và thu được dịch chiết có hàm lượng saponin là 1557,23 mg/100g cao hơn 1,5 lần so với mẫu không sử dụng enzyme ở cùng điều kiện [12]. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu cũng sử dụng enzyme α-amylase để xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột và polysaccharide trong rễ củ Đảng sâm nhằm chiết xuất hoạt chất sinh học và kết quả khảo sát nồng độ enzyme tối ưu cho quá trình chiết xuất được trình bày trên Hình 2. Phân tích kết quả thu được trên Hình 2 cho thấy, các mẫu dịch chiết Đảng sâm có sử dụng α-amylase với nồng độ 0%, 0,45%, 0,5%, 0,55% đều có có hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng kháng oxy hóa biến thiên tuyến tính lần lượt các phương trình: y = 1,543x - 0,725 (R2 = 0.978) - đối với mẫu 0%; y = 1,195x - 1,846 (R2 = 0.984) - đối với mẫu 0,45%; y = 1,835x + 3,452 (R2 = 0.976) - đối với mẫu 0,50%, và y = 0,890x – 0,393 (R2 = 0,989) - đối với mẫu 0,55%.

Như vậy, khả năng kháng oxy hóa của tất cả các mẫu với xúc tác enzyme đều tăng dần theo nồng độ enzyme sử dụng. Trong tất cả các mẫu, mẫu sử dụng 0,5% enzyme thể hiện tác dụng kháng oxy hóa mạnh nhất với mức kháng oxy hóa đạt 56,74% ở mức pha loãng 30% dịch chiết. Bên cạnh đó, 2 mẫu có sử dụng enzyme ở nồng độ 0,45% và 0,55% lại cho kết quả kháng oxy hóa thấp hơn mẫu 0,5% và thậm chí thấp hơn mẫu dịch chiết xuất không sử dụng enzyme. Nhóm nghiên cứu đi tới nhận định rằng, việc sử dụng chế phẩm α-amylase để xúc tác phản ứng thủy phân nguyên liệu rễ cử Đảng sâm ở các nồng độ khác nhau sẽ làm thay đổi hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết xuất Đảng sâm thu được và sử dụng α-amylase với nồng độ 0,5% có thể thu được dịch chiết xuất với khả năng kháng oxy hóa cao nhất, giá trị IC50 đạt mức 31,71 µg/mL.

Hiện nay, nhiều nhà khoa học trên thế giới có xu hướng nghiên cứu và sử dụng các hợp chất thiên nhiên nguồn gốc từ thực vật, có hoạt tính kháng khuẩn và đặc biệt an toàn cao để thay thế cho các loại kháng sinh thông dụng đang bị đề kháng [4]. Do đó, việc nghiên cứu xác lập hoạt tính kháng khuẩn của Đảng sâm là có tính thời sự. Tuy nhiên, kết quả từ thử nghiệm của nhóm nghiên cứu cho thấy, tất cả các mẫu dịch chiết xuất Đảng sâm với nồng độ là 125mg/mL đều không tạo được vòng kháng khuẩn.

(Ghi chú: 1 - Đối chứng âm; (+) – đối chứng dương (ampicillin); 2,3,4,5 - lần lượt là chiết xuất Đảng sâm sử dụng 0%, 0.45%, 0.5%, 0.55% enzyme α-amylase)

Từ đó, có thể kết luận rằng, dịch chiết xuất Đảng sâm không có hoạt tính kháng khuẩn với 3 chủng vi khuẩn nghiên cứu ở nồng độ 125mg/mL là Staphylococcus aureus, Salmonella và E. coli. Trong khi đó, đối chứng dương là ampicillin tạo được vòng kháng khuẩn rõ ràng so với cả 3 chủng vi khuẩn nghiên cứu. Nhóm nghiên cứu đã tăng nồng độ dịch chiết xuất Đảng sâm lên gấp 3 lần để khảo sát và kết quả thu được vẫn không thay đổi, điều này cho thấy, dịch chiết xuất Đảng sâm thu được sau phản ứng thủy phân nguyên liệu rễ củ với xúc tác là α-amylase không có tính kháng khuẩn. Tuy nhiên, mục tiêu ban đầu đặt ra của nghiên cứu là chiết xuất được dịch chiết xuất (nước cốt) Đảng sâm phục vụ pha chế làm nước giải khát, cho nên dịch chiết xuất không có tính kháng khuẩn không ảnh hưởng tới mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra.

Sau khi khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa (bắt gốc DPPH) và hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết xuất Đảng sâm, nhóm nghiên cứu tiến hành điều chế mẫu dịch chiết xuất Đảng sâm ở điều kiện tối ưu theo quy trình được thiết lập như sau: 25g Đảng sâm tươi xay nhuyễn và bổ sung nước theo tỷ lệ nguyên liệu: nước là 1:8 (w/v), điều chỉnh pH=5,5 bằng acid citric. Sau đó, bổ sung enzyme α-amylase với nồng độ 0.5% tính theo khối lượng nguyên liệu (w/w), khuấy đều. Tiếp tục, tiến hành phản ứng trong thiết bị phản ứng ổn nhiệt Stuart SI 500, thực hiện phản ứng ở nhiệt độ t = 83-85⁰C trong thời gian - 1,9 và liên tục khuấy đảo với vận tốc lắc v=200 vòng/phút. Kết thúc thời gian thủy phân, nâng nhiệt khối dịch thủy phân lên 95⁰C trong 15 phút bằng cách đun sôi cách thủy các hỗn hợp phản ứng, sau đó để nguội. Tiếp tục lọc dịch chiết nguội bằng giấy lọc, cấp độ lọc 1-2micron để thu dịch trong và loại bỏ cặn. Mẫu dịch chiết xuất Đảng sâm thu được như trên Hình 4 và một số đặc tính kỹ thuật của dịch chiết xuất Đảng sâm được trình bày trong Bảng 2

Phân tích kết quả thu được trong Bảng 2 cho thấy, mẫu dịch chiết xuất Đảng sâm thu được trong nghiên cứu này là Đảng sâm thu từ núi Ngọc Linh thuộc địa phận huyện Tu Mơ Rông (Kon Tum) có đặc tính kỹ thuật tương đồng với mẫu dịch chiết thu được trong nghiên cứu của Trương Hoàng Duy và cs. (2015) thu được từ rễ củ Đảng sâm từ Đà Lạt xét về hàm lượng saponin. Phân tích đặc tính cảm quan cho thấy, dịch chiết xuất Đảng sâm có màu sắc, mùi, vị rất phù hợp ứng dụng sản xuất nước giải khát Đảng sâm đóng chai và có thể tạo ra dòng sản phẩm nước cốt sâm đóng chai từ Đảng sâm tương tự như Hồng sâm Hàn Quốc để thương mại hóa, từ đó, nâng cao giá trị của Đảng sâm Kon Tum nói riêng và Đảng sâm từ các vùng khác nhau tại Việt Nam.

Nghiên cứu đã xác định được đặc tính sinh hóa của rễ củ Đảng sâm khai thác từ Tu Mơ Rông (Kon Tum) tương đối hoàn chỉnh, trong đó nổi bật là các chất dinh dưỡng gồm protein chiếm 6,4% chất khô, đường tổng (đường khử) chiếm 40,1% chất khô và protein chiếm 0,9% chất khô. Trích ly được chiết xuất Đảng sâm sử dụng xúc tác là enzyme α-amylase, dịch chiết xuất Đảng sâm có hàm lượng saponin đạt 1,54%, chiết xuất có hoạt tính kháng oxy hóa (bắt gốc DPPH) đạt mức 58,7%, nhưng không có tính kháng khuẩn. Nghiên cứu tạo tiền đề cho việc phát triển các sản phẩm nước giải khát từ nguyên liệu rễ củ Đảng sâm.