Việc sử dụng các đuôi dung hợp đã trở nên khá phổ biến với nhiều ứng dụng phong phú trong công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp, giúp làm đơn giản hóa quy trình phát hiện và tinh sạch protein. Tuy nhiên, các đuôi dung hợp với kích thước nhỏ hay lớn đều có một số ảnh hưởng nhất định đến cấu trúc bậc ba và hoạt tính sinh học của protein, mức độ tương tác phụ thuộc vào vị trí và thành phần amino acid của đuôi dung hợp. Vì vậy, các phương pháp loại bỏ đuôi dung hợp được áp dụng, bằng các phương pháp chính là hóa học và sinh học.

Trong đó, phương pháp sinh học với việc sử dụng các enzyme protease có hoạt tính nhận biết cắt ở những trình tự đặc hiệu được xem là một công cụ thay thế hữu hiệu hơn hẳn, enzyme cắt đặc hiệu khắc phục được hết những khuyết điểm của phương pháp cắt bằng chất hóa học. Hiện nay, các enzyme này được phân thành hai nhóm chính là thế hệ enzyme đầu tiên (như Enterokinase, Factor Xa, Thrombin); thế hệ tiếp theo (nhóm protease có nguồn gốc từ virus và có sự phân cắt đặc hiệu hơn như TEV và HRV3C).

Nhóm enzyme thế hệ đầu tiên mặc dù đã được sử dụng thành công để loại bỏ đuôi dung hợp, nhưng có nhược điểm là sự phân cắt protein mục tiêu tại các vị trí không chuyên biệt. Điều này được khắc phục gần như hoàn toàn với các protease có nguồn gốc từ virus thuộc thế hệ thứ hai như TEV và HRV3C. Bên cạnh việc ứng dụng để loại đuôi dung hợp theo cách truyền thống (in vitro: phản ứng cắt được thực hiện sau tinh chế qua cột hay trực tiếp trong cột tinh chế), gần đây, TEV và HRV3C còn được sử dụng để loại đuôi dung hợp ngay in vivo, tức là phản ứng cắt loại đuôi dung hợp diễn ra ngay bên trong tế bào biểu hiện. Tuy nhiên, để có thể sử dụng các protease này, cần tiến hành bước loại bỏ độc tố endotoxin, gây tốn kém về thời gian và tiền bạc. Chính vì vậy, việc nghiên cứu biểu hiện TEV lẫn HRV3C protease trên chủng chủ không sinh nội độc tố như Bacillus subtilis là thật sự cần thiết.

Với đề tài nêu trên, nhóm nghiên cứu triển khai tạo các chủng vi khuẩn để biểu hiện protein tái tổ hợp; hình thành các quy trình biểu hiện và tinh chế TEV và HRV3C cùng với các cơ chất của nó. Các chủng vi sinh vật mang plasmid tái tổ hợp sẽ được lên men để thu nhận protein mục tiêu.

Theo đó, các tác giả đã tạo vector cơ bản (pHT309) và vector biểu hiện His-TEV (pHT394); tạo vector cơ bản (pHT399), vector biểu hiện His-HRV3C (pHT399B) và vector biểu hiện His-GST-HRV3C (pHT399C); tạo vector biểu hiện BsLysSN-His-HRV3C/CS-GFP (pHT400B) để thử hoạt tính các enzyme HRV3C. Đồng thời tạo chủng B. subtilis mang các vector biểu hiện các protein mục tiêu, His-TEV và His-GST-HVR3C và protein cơ chất; biểu hiện và tinh chế các protein BsLysSN-His-TEV/CS-GFP làm cơ chất để đánh giá hoạt tính của TEV với nồng độ 1,75 mg/ml và độ tinh sạch 95,5%; biểu hiện và tinh chế protein BsLysSN-His-HRV3C/CS-GFP làm cơ chất để đánh giá hoạt tính của enyzme HRV3C với nồng độ 3,3 mg/ml và độ tinh sạch 96,5%; nghiên cứu điều kiện biểu hiện protein His-TEV (điều kiện phù hợp để biểu hiện His-TEV từ B. subtilis 1012/pHT394 là: 300C; 0,5 mM IPTG; thời gian cảm ứng 10 giờ). Ngoài ra, các tác giả cũng nghiên cứu điều kiện tinh chế protein His-TEV và kiểm tra hoạt tính: His-TEV từ B. subtilis 1012/pHT394 được thu nhận với nồng độ 2,75 mg/ml với độ tinh sạch là 95%, sản lượng 27,5 mg/L môi trường LB; His-TEV từ B. subtilis 1012/pHT394 có hoạt tính riêng 8,3 U/μg, tương đương với hoạt tính riêng của His-TEV biểu hiện bởi E. coli BL21(DE3)/pRK793.

Khảo sát sự biểu hiện His-HRV3C và His-GST-HRV3C cho thấy, điều kiện phù hợp để biểu hiện His-HRV3C từ B. subtilis 1012/pHT399B là 230C, 1 mM IPTG, thời gian cảm ứng 12 giờ; điều kiện phù hợp để biểu hiện His-GST-HRV3C từ B. subtilis 1012/pHT399C là 23⁰C, 0,5 mM IPTG, thời gian cảm ứng 12 giờ.

Tinh chế protein His-HRV3C và His-GST-HRV3C và kiểm tra hoạt tính: His-HRV3C được biểu hiện bởi chủng B. subtilis 1012/pHT399B với nồng độ là 2,68 mg/ml, độ tinh sạch 98% và sản lượng 16,2 mg/L môi trường LB. Protease này có hoạt tính riêng là 8,065 U/μg (hay 8065 U/mg). His-GST-HRV3C được biểu hiện bởi chủng B. subtilis 1012/pHT399C với nồng độ là 0,69 mg/ml, độ tinh sạch khoảng 95,5% và sản lượng là khoảng 3,27 mg/L môi trường LB. Protease này có hoạt tính 3,623 U/μg (hay 3623 U/mg). Khi xét về cùng số lượng phân tử (hay số lượng mol), His-HRV3C và His-GST-HRV3C biểu hiện bởi B. subtilis có hoạt tính tương đương nhau. His-GST-HRV3C được biểu hiện bởi chủng B. subtilis 1012/pHT399C có hoạt tính riêng tương đương với His-GST-HRV3C biểu hiện bởi chủng E. coli BL21(DE3)/pHT2281 nhưng thấp hơn GST-HRV3C biểu hiện bởi chủng E. coli BL21(DE3)/pGEX-4T-HRV3C. Điều này có thể giải thích là do ảnh hưởng của đuôi Histidine.

So sánh mức độ biểu hiện của TEV và HRV3C dung hợp trong B. subtilis so với E. coli, kết quả cho thấy, khả năng biểu hiện His-TEV của B. subtilis 1012/pHT394 tương đương E. coli BL21(DE3) mang plasmid thương mại pRK793; khả năng biểu hiện His-GST-HRV3C của B. subtilis 1012/pHT399C tương đương E. coli BL21(DE3)/pHT2281 nhưng thấp hơn khi so với sự biểu hiện GST-HRV3C của chủng E. coli BL21(DE3) mang plasmid thương mại pGEX-4T-HRV3C.

Về độ bền của các protein His-TEV, His-HRV3C, His-GST-HRV3C theo thời gian và điều kiện bảo quản: các protease His-TEV, His-HRV3C, His-GST-HRV3C biểu hiện bởi B. subtilis 1012 mang các plasmid tương ứng (pHT394, pHT399B, pHT399C) đều giữ nguyên hoạt tính khi bảo quản trong điều kiện -20^oC, -80^oC và thời gian 12 tháng kể từ khi tinh chế.

Như vậy, nhóm đề tài đã làm chủ được công nghệ tạo chủng và sản xuất protein tái tổ hợp TEV (tobaco etch virus protease) và HRV3C (human rhino virus 3C protease). Kết quả của đề tài cho thấy, việc sản xuất các protease TEV và HRV3C protease trên B. subtilis là hoàn toàn khả thi. Việc biểu hiện hai loại protease đóng vai trò quan trọng trong công nghệ tinh chế protein này từ chủng chủ an toàn Bacillus subtilis sẽ là tiền đề thúc đẩy khả năng ứng dụng chúng trong công nghệ protein tái tổ hợp phục vụ trong lĩnh vực y dược và thực phẩm. Đồng thời, kết quả nghiên cứu của đề tài là một minh chứng cụ thể cho tiềm năng ứng dụng sản xuất các protein tái tổ hợp của chủng chủ B. subtilis. Khả năng ứng dụng để đưa sản phẩm ra thị trường cao vì việc tinh chế protein tái tổ hợp này không cần phải qua bước loại độc tố endotoxin. Sản phẩm có thể sử dụng cho các nhà khoa học ở các trường, viện, công ty hay trong các công ty sản xuất dược phẩm, sản phẩm từ protein tái tổ hợp.