Astaxanthin là một hợp chất có nhiều tác dụng đã được công nhận, đặc biệt trong lĩnh vực y dược. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu tối ưu quy trình tách chiết astaxanthin từ vi tảo H.pluvialis nhằm thu hiệu suất cao nhất như phương pháp dùng dung môi hữu cơ kết hợp với các phương pháp phá vỡ tế bào nang hóa. Đề tài này nhằm tìm điều kiện tốỉ ưu đế tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo H. pluvialis bằng dung môi ethanol có xử lý viscozyme đạt hiệu suất cao nhất, đồng thời nghiên cứu tạo phức astaxanthin với β-cyclodextrin nhằm tăng độ hòa tan của astaxanthin trong nước đế ứng dụng trong ngành công nghiệp nước giải khát. Kết quả cho thấy, sử dụng dung môi ethanol 96% với tỷ lệ 0.04/10 (w/v) trong thời gian 60 phút, nhiệt độ 40°C đế tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo H .pluvialis cho hiệt suất đạt 2.41±0.04% (sinh khối khô). Bột phức astaxanthin-β-cyclodextrin tạo thành có khả năng hòa tan trong nước tốt hơn astaxanthin tách chiết không được cố định và khi bổ sung vào nước nha đam sau 7 ngày cho kết quả khả quan về khả năng hòa tan và mức độ bền màu của sản phẩm. Nghiên cứu này tạo tiền đề cho việc tối ưu hóa quy trình tách chiết và tinh sạch astaxanthin, khảo sát tính ổn định của phức astaxanthin-β-cyclodextrin, bổ sung vào các sản phẩm nước giải khát và đánh giá hiệu quả trong thời gian kế tiếp.

Từ khóa: astaxanthin, Haematococcuspluvialis, β-cyclodextrin, astaxanthin-β-cyclodextrin, viscozyme.

Các nghiên cứu gần đây cho thấy astaxanthin là chất có khả năng chống oxy hóa mạnh (Rao et al., 2010), có lợi cho hệ miễn dịch, hệ cơ tim, điều trị ung thư và trong điều trị lão hóa da (Rao et al., 2013, Ambati et al., 2014). Tảo lục Haematococcus pluvialis được dùng phổ biến nhất trong sản xuất astaxanthin tự nhiên ở quy mô thương mại, có thế tích lũy astaxanthin đến trên 2% Zhang et al., 2014).

Tuy nhiên, do nhu cầu sử dụng astaxanthin có nguồn gốc từ tự nhiên và có hoạt tính sinh học cao ngày càng tăng nên công nghệ sản xuất astaxanthin từ tự nhiên được chú trọng và phát triển, sự tổng hợp astaxanthin xuất hiện vi khuẩn Paracoccus carotinifaciens, (Tsubokura et al., 1999), nấm men Phaffia rhodozyma (Dominguez-Bocanegra et al., 2007;) và tảo lục (Rezanka et al., 2013). Tuy nhiên, tảo lục Haematococcus pluvialis được sử dụng phổ biến nhất cho sản xuất thương mại của astaxanthin.

Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu tối ưu quy trình tách chiết astaxanthin từ vi tảo H. pluvialis nhằm thu hiệu suất cao nhất như phương pháp dùng dung môi hữu cơ kết hợp với các phương pháp phá vỡ tế bào nang hóa như nghiền lạnh, xử lý acid/base, sấy phun...; và phương pháp tiên tiến nhất hiện nay là phương pháp tách chiết bằng CO2 lỏng siêu tới hạn với đồng dung môi ethanol hoặc dầu thực vật (Krlchnavaruk et al2008). Ethanol là một trong những dung môi có khả năng hòa tan các carotenoid có khối lượng phân tử lớn và được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Đặc biệt ethanol có thế được thu hồi đế tái chế thành các nhiên liệu sinh học. Đế thực hiện các phương pháp tách chiết hiện đại cần có vốn đầu tư kinh phí cao trong việc trang bị thiết bị máy móc, theo một số nghiên cứu cho thấy sử dụng viscozyme hoặc phương pháp nhiệt độ kết hợp chiết bằng dung môi hữu cơ có hiệu quả, do đó chúng ta có thế thực hiện được với một quy trình ít tốn kém hơn và giảm giá thành đối với sản phẩm thương mại.

Tuy nhiên astaxanthin là một chất rất kém tan trong nước nên rất khó đế ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Ngoài ra, astaxanthin là một chất nhạy cảm với nhiệt và ánh sáng nên có thế gây mất một số hoạt tính sinh học. Việc tạo phức astaxanthin với p- cyclodextrin có thế tăng khả năng hòa tan trong nước và tăng tính ổn định của astaxanthin (Chen et al, 2007), ngoài ra các nghiên cứu độc tính đã chứng minh rằng β-cyclodextrin tiếp nhận qua đường tiêu hóa là không độc hại (Bhardwaj et al, 2000).

Báo cáo này trình bày kết quả nghiên cứu tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo H.pluvialis và tạo phức astaxanthin với β-cyclodextrin đế thử nghiệm bổ sung vào nước giải khát. Trong đó, nghiên cứu khảo sát nồng độ dung môi ethanol (từ 90 đến 98%), tỷ lệ sinh khối tảo khô/thế tích dung môi (từ 0.02/10 đến 0.06/10 (w/v)), thời gian xử lý (từ 30 phút đến 150 phút), nhiệt độ (từ 30 đến 60°C); nghiên cứu tạo phức astaxanthin (O.lg) với β-cyclodextrin (nồng độ 0.06 mol/L) ở 50°C đánh giá qua khả năng tan trong nước của phức so VỚI astaxanthin khl chưa cố định; bước dầu bổ sung phức astaxanthin-β-cyclodextrin vào nước uống nha đam (tỷ lệ 0.3g/350mL và 0.4g/350mL).

Sinh khối của vi tảo H. pluvialis CCAC 0125 được thu nhận qua quá trình nuôi cấy cố định trên hệ thõng hal lớp màng theo phương nghiêng tại trường Đại học Nguyễn Tất Thành (Tran et al., 2019; Do et al., 2019). Vê cơ bản, 5 g tảo khô được cố định trên màng nuôi dưới điều kiện và chiếu sáng bằng đen Natri cao áp với cường độ ánh sáng 400-600 pmol photon.m-2.s-l, theo nhịp sáng tối 14/10, co2 cung cấp 2-5% vào dung dịch nuôi BG-11. Sinh khối vi tảo chứa astaxanthin thu hoạch sau 10 ngày nuôi.

Astaxanthin được tách chiết bằng dung môi ethanol sau đó đo độ hấp thu ở bước sóng 480 nm và dựa vào đường chuẩn astaxanthin đế xác định hàm lượng astaxanthin thu được. Đường chuẩn được xây dựng theo các bước sau: (1) Chuẩn bị dãy dung dịch astaxanthin chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0-60 pg/mL từ chất chuẩn astaxanthin tinh khiết 97% (Sigma) và dung môi ethanol (Fisher); (2) Đo độ hấp thu của dãy dung dịch chuẩn vừa chuẩn bị bằng máy đo quang phổ (CT-2200 Spectrophotometer) ở bước sóng 480 nm; (3) Lập phương trình đường chuẩn có dạng y = ax + b, với y: độ hấp thu ánh sáng của dung dịch ở bước sóng 480 nm và x: nồng độ của dung dịch chuẩn pg/ml; (4) lượng astaxanthin (AST) trong 10 mL dịch chiết được tính theo công thức:

AST (mg) = X*L*10*10-3

Trong đó: AST (mg): hàm lượng astaxanthin trong 1 mL dịch chiết; X (pg/mL): nồng độ astaxanthin trong 1 mL dịch chiết; L: hệ số pha loãng.

Được mô tả bởi Chen và cs (2007) được sử dụng và có một số cải tiến: (1) Dung dịch β-cyclodextrin trong nước với nồng độ 0,06 mol/l được khuấy ở 50°C; (2) Astaxanthin 0.1 g được hòa tan trong ethanol ở 50°C và thêm vào dung dịch; (3) Hỗn hợp được khuấy ở 50°C trong 4 giờ. Ethanol đã được loại bỏ bằng cách cô quay; (4) Dung dịch được làm nguội đến 25°c, khuấy tiếp trong 8 giờ và được bảo quản qua đêm ở 4°c. (5) Sau đó lọc và sản phẩm kẽt tủa thu được làm khô Ở50oc.

2.2.3.   Bổ sung vào nước giải khát: sản phẩm bột phức astaxanthin-β-cyclodextrin được bổ sung vào nước uống nha đam (Công ty V.U.A Biotech) đế theo dõi tính ổn định của phức tại nhiệt độ phòng bằng phương pháp đánh giá cảm quan các yếu tố màu sắc và độ hòa tan.

Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này đều đạt chuẩn phân tích như ethanol (Prolabo), β-cyclodextrin (Sigma), astaxanthin 97% (Sigma).

2.2.4 Phân tích dữ liệu: Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016. Các phân tích thống kê, biếu đồ được thực hiện bằng phần mềm R phiên bản 3.4.2. Các giá trị được trình bày ở dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) của ít nhất 3 lần lặp lạl nghiệm thức.

Trong nghiên cứu này, các nồng độ dung môi ethanol đế tách chiết astaxanthin từ vi tảo H.pluvialis lần lượt là 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, do vậy đường chuẩn astaxanthin cũng được xây dựng ở 5 nồng độ dung môi nói trên.

Meyer và Du Preez (1994) chỉ mới xây dựng đường chuẩn đế định lượng astaxanthin ở chủng nấm men Phaffia rhodozyma trong dung môi methanol, tuy nhiên phương pháp định lượng vẫn chưa nói lên định lượng cụ thế ở nồng độ dung môi methanol nào.

Theo định luật Lambert-Beer: A = e.b.c (trong đó e là hệ số hấp thu phân tử, c nồng độ dung dịch (mol/l), b độ dày truyền ánh sáng (cm), A là độ hấp thụ quang), từ đó ta thấy độ hấp thụ quang phụ thuộc vào e, b, c. Mà e phụ thuộc vào bản chất dung môi nên ở các nồng độ dung môi khác nhau thì độ hấp thụ quang A cũng thay đổi.

Vì vậy đế đảm bảo độ chính xác, chúng tôi tiến hành xây dựng 5 đường chuẩn định lượng astaxanthin ở 5 nồng độ dung môi ethanol khảo sát. Kết quả các đường chuẩn astaxanthin trong các nồng độ dung môi khác nhau được thế hiện ở Hình 1.

Nồng độ ethanol có ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết astaxanthin, khi nồng độ ethanol tăng từ 90 lên 96% (v/v) thì hiệu suất tách chiết astaxanthin cũng tăng theo, nhưng ở nồng độ 98% thì hiệu suất tách chiết astaxanthin giảm xuống mức có ý nghĩa (p < 0.05). Do astaxanthin tan tốt trong dung môi hữu cơ, rất ít tan trong nước, nên khi nồng độ dung môi càng tăng thì hiệu suất tách chiết astaxanthin càng tăng. (Hình 2)

Haque et al. (2016) đã sử dụng dung môi ethanol 99% kết hợp siêu âm đế tách chiết astaxanthin từ vi tảo H.pluvialis thu được hàm lượng astaxanthin tách chiết 0.211 ± 0.001 mg/g. Ở nghiên cứu này, nồng độ ethanol dùng đế tách chiết cho hiệu suất tách chiết astaxanthin cao nhất là 96% với hàm lượng astaxanthin thu được là 15.7 mg/g. So với nghiên cứu của Fatima Haque et al. (2016), phương pháp này có những ưu điếm hơn đó là sử dụng nồng độ ethanol thấp nên tiết kiệm chi phí dung môi, không sử dụng siêu âm đế phá vỡ tế bào và hiệu suất tách chiết astaxanthin cao hơn.

Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu/thế tích dung môi đến quá trình tách chiết astaxanthin được thế hiện trong hình 3. Khi tăng tỷ lệ khối lượng sinh khối tảo khô/thế tích dung môi từ 0.02/10 (w/v) đến 0.04/10 (w/v) thì hiệu suất tách chiết astaxanthin thu được tăng lên, tuy nhiên khi tăng tỷ lệ khối lượng sinh khối tảo khô/thế tích dung môi từ 0.04/10 đến 0.06/10 thì hiệu suất tách chiết bắt đầu giảm xuống có ý nghĩa (p < 0.05). Hiệu suất tách chiết cao nhất đạt 1.85a ± 0.11 % (18.5 mg/g) tại tỷ lệ 0.04/10 (w/v).

Các kết quả này phù hợp với nguyên tắc truyền khối mà động lực cho khối lượng chuyến khối được coi là gradient nồng độ giũa chất rắn và dung môi. Tỷ lệ mẫu/dung môi cao có thế thúc đẩy một gradient nồng độ càng tăng, dẫn đến tăng tốc độ khuếch tán cho phép quá trình trích ly chất rắn bằng dung môi được tốt hơn (Al-Farsi và Chang, 2007).

Hiệu suất tách chiết tăng từ 30 phút đến 60 phút và sau đó hiệu suất giảm xuống từ 90 đến 150 phút ở mức có ý nghĩa (p < 0.05). Theo kết quả ở Hình 4, hiệu suất tách chiết cao nhất đạt 19.6a ± 0.08 % (19.6 mg/g) tại thời gian 60 phút.

Thời gian ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết astaxanthin (Galhlane et al. 2006), khi tăng thời gian tách chiết thì hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ tăng tuy nhiên đến một thời gian tối ưu thì hiệu suất tách chiết sẽ không tăng lên đáng kế mà còn có xu hướng giảm xuống. Vì vậy trong nghiên cứu này, tại thời gian 60 phút là thời gian tách chiết tối ưu.

Hiệu suất tách chiết astaxanthin tăng khi nhiệt độ tách chiết tăng từ 30 đến 40°C và sau đó hiệu suất giảm xuống có ý nghĩa (p < 0.05) từ 40 đến 60°C do sự phân hủy của astaxanthin (Hình 5). Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng trong quá trình tách chiết các hợp chất nhạy cảm với nhiệt. Củng với sự gia tăng nhiệt độ, tốc độ khuếch tán dung môi và sự tăng cường truyền khối sẽ giải phóng các thành phần trong vi tảo.

Hiệu suất tách chiết cao nhất đạt 2.41a ± 0.04 % (tương đương với 24.10 mg/g) tại nhiệt độ 40°C, tương tự với kết quả khảo sát nhiệt độ tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo H.pluvialis bằng hỗn hợp đổng dung môi ethanol-etylacetate của Zou et al (2013) cho hàm lượng astaxanthin cao nhất là 23.94 ± 0.43 mg/g tại nhiệt độ 40°C.

Ưu điếm của nghiên cứu này so với nghiên cứu của Zou et al (2013) là không sử dụng đồng dung môi và siêu âm vẫn cho hiệu suất cao, phương pháp tách chiết đơn giản và tiết kiệm hơn.

Astaxanthin là một phân tử rất kém tan trong nước nên rất khó đế ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và đồ uống. Ngoài ra, astaxanthin là một chất nhạy cảm với nhiệt và ánh sáng nên có thế gây mất một số hoạt tính sinh học. Việc tạo phức astaxanthin với β-cyclodextrin có thế tăng khả năng hòa tan trong nước và tăng tính ổn định của astaxanthin (Chen et al, 2007).

β-cyclodextrin là một trong những cyclodextrin thuộc họ oligosaccharide vòng với lỗ hổng trung tâm ưa chất béo và bề mặt ngoài ưa nước (Arun et al., 2008). Theo Valle (2003), ở 25oC, β-cyclodextrin có độ hòa tan 18.5 (g/l), độ hòa tan trong nước có giới hạn nên phức chất của β-cyclodextrin có độ tan giới hạn dẫn đến sự kết tủa của phức β-cyclodextrin rắn từ nước và những hệ thống có nước khác.

Khi hòa tan trong nước tinh khiết, các lỗ hổng của β-cyclodextrin sẽ chứa nước. Và các nghiên cứu độc tính đã chứng minh rằng β-cyclodextrin được phân phối bằng đường uống là không độc hại (Bhardwaj et al, 2000). β-cyclodextrin có khả năng tạo phức chất lồng nhau ở trạng thái dung dịch và rắn (loại chủ thế-khách thể) với các chất ưa béo dạng rắn, lỏng, khí bằng sự tạo phức phân tử (Arun et al., 2008).

Động lực chính của quá trình tạo phức là sự thay thế các phân tử nước chứa trong lỗ hổng với sự có mặt của phân tử khác kỵ nước (astaxanthin) trong dung dịch đế đạt sự kết hợp không cực - không cực và làm sự căng vòng β-cyclodextrin đưa đến trạng thái năng lượng ổn định thấp hơn (Szetjli, 1998). Phức có thế được hình thành cả trong dung dịch hoặc trong trạng thái tinh thế và nước là dung môi được lựa chọn.

Phức astaxanthin-β-cyclodextrin tan trong nước tốt hơn astaxanthin bởi vì astaxanthin bị bẫy trong β-cyclodextrin dẫn đến sự thay đổi sâu sắc các tính chất hóa, lý và sinh học vì astaxanthin tạm thời bị khóa hoặc bị giữ trong lỗ hổng của p- cyclodextrin, dẫn đến sự thay đổi có lợi cho astaxanthin. Đối vowisi astaxanthin chưa tạo phức bản thân là một chất ưa béo nên rất ít tan trong nước vì vậy khi cho hòa tan vào nước sẽ dẫn đến hiện tượng astaxanthin không tan hết, trên bề mặt nước có nổi lên váng dầu béo không đồng nhất.

Vì vậy đế dễ dàng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, trong đề tài nghiên cứu này đã bước dầu thực hiện cố định astaxanthin với β-cyclodextrin thành công nhằm tăng độ hòa tan của astaxanthin trong nước. Theo Chen et al. (2007), sử dụng hỗn hợp đồng dung môi dịch loromethane/acetone (1:1) đế thực hiện phản ứng đồng kết tủa đế tạo phức astaxanthin với β- cyclodextrln nhằm tăng độ hòa tan và độ bền màu của phức. Trong nghiên cứu này đã có những cải tiến mới đó là chỉ dùng dung môi ethanol đế hòa tan astaxanthin vì dùng hỗn hợp đồng dung môi dịch loromethane/acetone đế thực hiện phản ứng đồng kết tủa đế tạo phức (Hình 6).

​

Sản phẩm bột phức astaxanthin- β-cyclodextrin được bổ sung vào nước uống nha đam đế theo dõi tính ổn định của phức tại nhiệt độ phòng bằng phương pháp đánh giá cảm quan các yếu tố màu sắc và độ hòa tan. (Hình 7)

Qua 7 ngày theo dõi độ ổn định của phức, kết quả cho thấy rằng khả năng hòa tan và độ bền màu của phức ổn định, không bị căn lắng (Hình 7). Vì vậy đế tăng tính ổn định của phức astaxanthin-β-cyclodextrin về độ bền màu, cần phải tiến hành thêm nghiên cứu sâu hơn, tạo phức có độ ổn định cao và đánh giá hoạt tính sinh học của sản phẩm tạo phức.

Nghiên cứu này đã thực hiện thành công việc sử dụng dung môi ethanol 96% với tỷ lệ 0.04/10 (w/v) trong thời gian 60 phút, nhiệt độ 40°C đế tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo H .pluvialis cho hiệt suất đạt 2.41±0.04% (sinh khối khô). Bột phức astaxanthin-β-cyclodextrin được tạo thành từ astaxanthin thu nhận ở trên và β-cyclodextrin cho thấy có tính tan trong nước tốt hơn astaxanthin khi chưa cố định. Bột phức astaxanthin-p- cyclodextrin sau đó bổ sung vào nước uống nha đam ở các nồng độ 0.3 g/350 mL và 0.4 g/350 mL. Sau 7 ngày cho thấy mức độ hòa tan giữa phức và nước giải khát và độ bền vững màu là tốt (theo phương pháp đánh giá cảm quan). Nghiên cứu này tạo tiền đề cho việc tối ưu hóa quy trình tách chiết và tinh sạch astaxanthin, khảo sát tính ổn định của phức astaxanthin- - cyclodextrin, bổ sung vào các sản phẩm nước giải khát và đánh giá hiệu quả trong thời gian kế tiếp.

ALAM MN, BRISTI NJ, RAFIQUZZAMAN M, (2013) Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharm J 21:143-152.

AMBATI RR, PHANG SM, RAVI 5, ASWATHANARAWAYANA RG, (2014). Astaxanthin: Sources, extraction, stability, biological activities and its commercial app I ications-A Review, Mar. Drugs 12(1): 128-152.

BAKER BR, SALING p, (2003). Comparing natural with chemical additive production. Feed Mix 11:12-14.

CHANG cs, CHANG CL AND LAI GH, (2013). Reactive oxygen species scavenging activities in a chemiluminescence model and neuroprotection in rat pheochromocytoma cells by astaxanthin, beta-carotene, and canthaxanthin. Kaohsiung J. Med. Sci. 29 (8): 412-421.

CHEN X, CHEN R, GUO z, LI c AND LI p, (2007). The preparation and stability of the inclusion complex of astaxanthin with K-cydodextrin. Food Chemistry 101(4): 1580-1584.

DO TT, PHAM CH, NGUYEN TC, MELKONIAN M AND TRAN HD, (2019). Biomass and astaxanthin productivities of Haematococcus pluvialis in an angled Twin-Layer photobioreactor: effect of inoculum density and storage time. Applied Microbiology and Biotechnology, (under review)

DONG s, HUANG Y, ZHANG R AND WANG s, (2014). Four Different Methods Comparison for Extraction of Astaxanthin from Green Alga Haematococcus pluvialis. The ScientificWorld Journal 2014(9): 1-7.

GENGATHARAN A, DYKES GA, (2015). Wee Sim Choo, Betalains: Natural plant pigments with potential application in functional foods. LWT-Food Science and Technology 64:645-649.

HAQUE F AND MAHENDRA AD, (2016). Intensified Green Production of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis. Food and Bioproducts Processing: 30004-9.

KANG CD AND SIM SJ, (2007). Direct extraction of astaxanthin from Haematococcus culture using vegetable oils. Biotechnol Lett 30:441 -444.

KIPERSTOK AC, SEBESTYEN p, PODOLA B, MELKONIAN M, (2017). Biofilm cultivation of Haematococcus pluvialis enables a highly productive one-phase process for astaxanthin production using high light intensities. Algal Research 21:213-222.

LI A, LI s, ZHANG Y, XIANG-RONG XU, YU-MING CHEN AND HUA-BIN LI (2014). Resources and Biological Activities of Natural Polyphenols. Nutrients 2014,6:6020¬6047.

LORENZ RT AND ƠSEWSKI (2000). Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin. Trends Biotechno1.18(4): 160-167.

MEYER JC, PREEZ JCD, (1994). Effect of culture conditions on astaxanthin production by a mutant of Phaffia rhodozyma in batch and chemostat culture. Applied Microbiology and Biotechnology 40(6): 780-785.

SHAH MM, LIANG Y, CHENG JJ, DAROCH M, (2016). Astaxanthin-Producing Green Microalga Haematococcus pluvialis: From Single Cell to High Value Commercial Products. Front Plant Scien (7): 531.

TRAN HD, DO TT, LE TL, NGUYEN MLT, PHAM CH AND MELKONIAN M, (2019). Cultivation of Haematococcus pluvialis for astaxanthin production on angled bench¬scale and large-scale biofilm-based photobioreactors. Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering, (under review).

WAN M, HOU D, LI Y, FAN J, HUANG J, LIANG s, WANG w, PAN R, WANG J, LI s, (2014). The effective photoinduction of Haematococcus pluvialis for accumulating astaxanthin with attached cultivation. Bioresour. Technol. 163:26-32.

ZHANG w, WANG J, LIU T, (2014). Attached cultivation of Haematococcus pluvialis for astaxanthin production. Bioresour. Technol. 158:329-335.

zou TB, JIA a LI HW, WANG a AND wu HF, (2013). Response Surface Methodology for Ultrasound-Assisted Extraction of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis. Mar. Drugs 11 (5): 1644-1655.